对于CRISPR/Cas9基因编辑的敲除效率验证，为什么不建议使用qPCR或WB方法？

CRISPR/Cas9介导的基因敲除可以在靶位点创造DNA双链断裂（DSB），再通过细胞的非同源末端连接（NHEJ）进行修复，导致永久突变 ，如在修复位点产生小插入或缺失。某些突变会产生移码，终止密码子提前出现等，从而导致靶基因功能缺失。

此时使用qPCR检测敲除后的靶基因表达水平，仍有可能检测到该基因转录的mRNA分子。这是因为编码基因的mRNA降解效率受诸多因素影响，比如敲除后的提前终止密码子与起始密码子的距离过短，无意义机制介导的mRNA降解（NMD）效率将显著降低，此时细胞中的mRNA水平表现出没有非常明显的下降，导致qPCR结果无法印证DNA水平的基因敲除效果。

在蛋白水平上，如果蛋白在翻译阶段跳过了被敲除的外显子，蛋白仍然可以表达，特别是对于分子量较大的蛋白，一个大小很小的外显子被编辑后，WB上无法观察到显著的区别。此外细胞也具有翻译重起始机制（Reinitiation），当该机制激活时，也将补偿被编辑的蛋白表达。这些因素都将导致WB无法印证基因敲除的效果。