重组狂犬病毒（RABV）

运输与存储

我们的RABV病毒保存于HBSS缓冲液，并以干冰形式运输。接收到病毒后，RABV可以在-80°C长期存储（可至少稳定存储6个月），或者在-20°C存储一周。RABV的保质期约为1年。请避免反复冻融RABV以避免显著的滴度下降。

RABV制备与质量控制

RABV包装流程如图2所示。携带GOI的转移质粒、分别携带RABV G、N、P、L基因的包装质粒、以及一个表达T7 RNA聚合酶的质粒一同转染包装细胞。包装质粒表达的病毒蛋白对于含有目的基因的病毒颗粒组装是必须的。制备覆盖有G糖蛋白的RABV后，收集细胞上清，再次感染包装细胞。此时若同时转染一个表达异源包膜蛋白的质粒（比如表达EnvA），则可以获得假型化的RABV病毒。对于非纯化的RABV病毒（体外应用级别），使用超速离心法浓缩纯化。对于超纯化的RABV病毒（体内应用级别），使用蔗糖密度梯度离心法浓缩纯化。我们使用噬斑法检测滴度。

图2 典型的RABV包装流程。

对于每一个生产的重组RABV病毒，质量控制包括滴度检测、无菌测试、支原体检测等。如果RABV病毒载体表达荧光蛋白，则我们会进行荧光转导测试。如果RABV病毒载体含有药筛标记，我们也会在转导测试后伴随进行药筛测试。此外，对于超纯化RABV，我们会进行内毒素检测。

试验验证

我们的RABV经详尽验证可以有效转导多种细胞类型，包括表达TVA受体的细胞 （图3）

图3 表达EGFP的RABV转导293T细胞（表达或无表达TVA）。转导后48小时使用荧光显微镜成像。放大倍数：100×。左：明场。右：EGFP。

RABV背景知识

RABV是一种负链RNA病毒，属于弹状病毒科。RABV基因组长度约为12 kb，可以插入3-5 kb的转基因片段。该病毒使用G糖蛋白来识别通常在神经元轴突末端发现的各种受体。野生型RABV一旦进入轴突末端，病毒就会逆行传输到细胞体，并在那里进行复制。RABV的病毒复制和转录均发生在细胞质中，最大限度地减少了整合宿主基因组的风险，且降低了病毒生命周期对宿主机制的依赖。

复制后的病毒被随后运输到神经元树突，并以出芽方式释放。这种高度嗜神经性的病毒仅能通过化学突触传播到其他细胞，感染新的轴突末端，并经由外周和中枢神经系统继续传播到突触前神经元。

RABV载体的主要应用

神经网络展示

重组RABV主要用于神经网络的突触追踪（图4）。RABV有着逆行传输以及跨突触传播的限制，因此可实现对神经连接的特定可视化和调控。RABV载体通常缺失G糖蛋白基因，因此病毒在感染一级神经元后无法传播至其它细胞。 然而，当病毒被引入具有G糖蛋白表达的细胞时（比如通过AAV转导引入），可产生的功能性病毒，然后传播且只能传播至上游二级神经元，实现单突触追踪。

特定神经元中的单突触连接研究也是一种常见的实验需求。使用EnvA/TVA系统将允许病毒靶向特定神经元：整合了EnvA包膜蛋白的假型化RABV特异性感染同时表达TVA受体以及G糖蛋白的一级神经元。这将确保只有靶细胞被重组RABV感染，并允许对所有直接输入进行单突触追踪。

图4 重组RABV的生产、转导和感染。

疫苗制备

狂犬病是一种出现症状后致死率接近100%的疾病，其疫苗的开发也是一个热点问题。目前灭活RABV是最常用的疫苗载体形式，但是具备自我复制能力的重组RABV疫苗载体也在被进一步研究。 HEP-Flury毒株因其高度减毒、低致病性和较强的免疫原性而特别适合于该种应用。

视频

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文档

暂无

常见问题解答