点突变细胞稳转株

云舟生物的点突变细胞稳转株可针对细胞基因组靶序列创造点突变。我们的点突变细胞采用CRISPR相关技术制备，需要针对转导细胞的靶序列导入一个特异性的gRNA/Cas9 RNP复合物，以及一个可通过HDR修复方式引入突变序列模板的供体载体。我们拥有一系列独特的技术，可让我们在很短的周期内实现具有高HDR率的高效基因递送，高成功率获得敲入纯合子。

亮点：

超高点突变效率：使用我们设计的供体载体和基因递送方式，靶细胞的HDR率可达到50%。
非病毒基因递送方式：基于电转法的RNP实现高效基因递送且脱靶率低。
周期短：载体设计完成后的纯合子突变细胞从改造到交付快至18周。

服务详情

Workflow for gene overexpression stable cell line engineering

图1 点突变细胞稳转株的构建流程。

订购信息

服务	交付内容	价格(CNY)	周期
点突变细胞稳转株构建	一个纯合子单克隆细胞株（>10⁶个细胞/管, 2管）	￥40,980起	12-18周

* 增加交付单克隆数将收取额外费用。

QC试验

试验项目	方法
点突变验证（默认）	PCR、Sanger测序
表达测试（额外收费）	RT-qPCR、WB、IF、FACS
脱靶效应分析（额外收费）	NGS、PCR、Sanger测序
染色体分析（额外收费）	核型分析
无菌测试（默认）	PCR检测支原体、生物负荷检测等

下游服务

对于您的细胞稳转株，我们可以开展多种类型的表型分析和功能验证，保括细胞增殖、凋亡、迁移、细胞活力、细胞毒性等。

案例分析

图2 使用我们的点突变方法在不同类型细胞中测试突变率。

Validation of point mutations in THP-1 cells

图3 在THP-1细胞中验证点突变效果。（A）Sanger测序检测GOI序列中的点突变。红色方框的位置是非同义突变，绿色方框的位置是同义突变。（B）对突变细胞（PM）和野生型细胞（WT）的靶位点PCR，PCR产物显示其长度相同，表明点突变没有引发序列结构性变异。

常见问题解答

ssODN和dsDNA，哪一种方式更适合用于引入点突变？▼

对于小片段插入，ssODN通常是最佳的选择，具有操作简易，不会随机插入等优点。然而，ssODN的模板大小只能小于200 bp，对于大片段插入，可以使用dsDNA作为供体序列模板。无论采用哪一种方法，切割位点到突变位点的距离不超过至10 bp（对于ssODN）或者1 kb（对于dsDNA供体）时，可以保证较高的整合效率。

为什么需要引入同义突变？▼

尽管同义突变的氨基酸序列不变，但是会影响密码子偏好性、mRNA结构、稳定性以及翻译效率。在细胞株中引入同义突变有助于研究这些转录后阶段可能产生的变化。此外，引入同义突变还可以扰乱CRISPR组分的靶序列（即PAM序列以及其邻近序列），抑制脱靶效应造成和旧CRISPR-Cas9编辑位点造成的非目标切割。