云舟生物可以为您的目的基因构建敲低效果长效的细胞稳转株。为保证敲低效率，每个细胞株独自接受来自3个shRNA慢病毒中的一个的病毒转导。经过RT-qPCR验证，我们交付敲低效率最佳的细胞株。此外，每批细胞产品放行前，我们还会开展一系列QC试验，比如无菌测试、支原体检测等。
亮点：
图1 基因敲低稳转细胞株的构建流程。
| 服务 | 交付内容 | 价格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 基因敲低细胞稳转株构建 | 多克隆细胞群（>106个细胞/管，2管） | ￥18,980起 | 8-11周 |
| 两个单克隆细胞株（>106个细胞/管，每个克隆各2管） | ￥21,980起 | 13-16周 |
* 增加交付单克隆数将收取额外费用。
| 试验项目 | 方法 |
| 基因敲低验证（默认） | RT-qPCR |
| 表达测试（额外收费） | RT-qPCR、WB、IF、FACS |
| 无菌测试（默认） | PCR检测支原体、生物负荷检测等 |
图2 在Hep-G2细胞中高效敲低DNAJC12基因。（A）携带EGFP的DNAJC12 shRNA慢病毒转导Hep-G2。（B）RT-qPCR检测基因敲低效率达90.9%。三次重复试验；p value<0.001。
我们设计和评估shRNA的规则与RNAi consortium（TRC）使用的规则类似。对于每个RefSeq转录本，我们会搜索出所有的21 mers作为候选靶位点。以下因素会降低干扰效率/特异性或影响克隆，含有这些特点的序列将会被排除。主要因素包括：含有≥4个连续相同碱基，含有≥7个G或C，GC含量<25％或> 60％以及序列的5'端含有AA碱基。如果靶点内部含有茎环结构，或是3'末端的GC含量较高，或是该靶点是已知的miRNA核心序列或是会打靶到其他基因，则该靶点的分值就会较低。若靶位点存在于一个基因的多个转录本，则该靶点的分值就会较高。 所有的干扰分值均≥0，平均数约为5，标准差约为5，95%的分值均≤15。若一个shRNA的干扰分值是15，则表示具有很高干扰效率且易于克隆；若干扰分值为0，则表示干扰效果较差或难以克隆。
为了确定哪种方法最适合您的实验应用，以下是您应该考虑的一些事项。
基本原理
基因敲低载体表达shRNA抑制靶基因的mRNA，通过引发mRNA的切割抑制翻译过程。shRNA敲低不改变靶基因的DNA序列。
CRISPR和TALEN都是通过指导核酸酶切割基因组中的特定靶位点来发挥作用。然后这些切割位点被细胞低效地修复，从而导致修复部位的永久性突变，比如产生基因的小片段插入或碱基缺失。这类突变的一部分会导致基因的阅读框移码、出现提前终止密码子等，最终导致目的基因的功能丧失。如果同时靶向基因组中两个相邻紧密的切割位点（距离几个kb），也可以导致其间区域的删除。
效率
shRNA敲低永远不会完全抑制靶基因的表达。即使对于最有效的shRNA，靶基因的一些残留表达也会保留。相比之下，在一小部分经过处理的细胞群中，CRISPR和TALEN可以产生永久性突变，这可能导致基因功能完全丧失。
一致性和均一性
shRNA载体通常在转染/转导的细胞时获得较好的均一性，实验之间的一致性也较佳。相比之下，由于引入突变是随机的，CRISPR和TALEN的基因编辑效果在细胞之间的差异相当大。为了完全敲除细胞中的目的基因，必须敲除细胞中基因的所有拷贝。鉴于正常细胞具有任何基因的两个拷贝（X或Y连锁基因除外），而癌细胞可以具有两个以上的拷贝，这种完全敲除的细胞可能只占所有处理后的细胞的一小部分。出于这个原因，核酸酶介导的敲除实验需要通过测序来筛选克隆，以确定所有目的基因拷贝都被敲除的子细胞群。
脱靶效应
已有报道表明shRNA介导的基因敲低和核酸酶介导的基因敲除均会产生脱靶效应。脱靶效应的表征可以通过使用多个不同的shRNA 靶向同一基因来评估。如果一个基因被在多个不同的shRNA作用下仍然表现出一致的表征，则这种表征通常则不是脱靶效应带来的。对于CRISPR或TALEN基因敲除，应分析含有功能丧失突变的多个克隆，以包含可能由脱靶突变引起的任何表征。此外，可以对克隆进行脱靶位点测序，通过生物信息学方法鉴定以查看它们是否已发生突变。
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