载体构建

在分子生物学中，载体是一种可以携带外源核酸序列进入靶细胞中的物质，有质粒DNA载体、人工染色体载体、病毒载体等多种形式。基因工程最常使用的载体是质粒DNA载体，通常包含复制起点、启动子、筛选标记等多种载体元件。构建质粒DNA载体的目的即是要将外源DNA片段插入到质粒骨架上。该质粒可以在宿主菌中自我复制，并且在一些情形下进一步用于下游的细胞转染或者病毒包装等实验，从而实现外源DNA在靶细胞中的表达。

传统实验室方法构建含有目的基因的重组质粒DNA载体一般采用酶切连接法，其操作流程概括如下：

1、用一定量的DNA限制性内切酶切割质粒，使质粒出现缺口，切口处的黏性末端暴露；
2、再用DNA限制性内切酶处理目的基因的DNA片段，使其产生对应的黏性末端；
3、将处理好目的基因片段以与切割好的质粒混合。目的基因片段的黏性末端和质粒切口的黏性末端互补配对；
4、再加入适量的DNA连接酶，催化目的基因片段和质粒DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组质粒DNA分子。
5. 重组质粒DNA转化大肠杆菌并扩增，然后筛选转化后的克隆并验证目的基因的连接效果。

对比效率较低的酶切连接法，云舟生物可使用多种高通量策略进行载体克隆。在我们的高度优化的克隆平台上，一般的表达载体我们使用Gateway克隆和Gibson组装等方式构建，而shRNA和gRNA载体则使用基于直接连接的方式快速构建。此外，根据具体项目的需要，我们也可以使用从头基因合成、Golden Gate等方式构建载体。