云舟生物的基因敲入稳转细胞株可实现对细胞基因组靶位点的永久敲入。我们的基因敲入细胞采用CRISPR相关技术制备，需要针对转导细胞的靶位点导入一个特异性的gRNA/Cas9 RNP复合物，以及一个可通过HDR修复方式引入供体序列的供体载体。我们拥有一系列独特的技术，可让我们在很短的周期内实现具有高HDR率的高效基因递送，高成功率获得敲入纯合子。
亮点：
图1 基因敲入稳转细胞株的构建流程。
| 服务 | 交付内容 | 价格(CNY) | 周期 |
|---|---|---|---|
| 基因敲入细胞稳转株构建（插入片段<3 kb） | 一个单克隆细胞株（>106个细胞/管, 2管） | ￥40,980起 | 14-20周 |
| 两个单克隆细胞株（>106个细胞/管, 每个克隆各2管） | 请咨询 | ||
| 基因敲入细胞稳转株构建（插入片段>3 kb） | 一个单克隆细胞株（>106个细胞/管, 2管） | ￥67,980起 | 16-24周 |
| 两个单克隆细胞株（>106个细胞/管, 每个克隆各2管） | 请咨询 | ||
* 增加交付单克隆数将收取额外费用。
| 试验项目 | 方法 |
| 基因敲入验证（默认） | 基因型PCR、Sanger测序 |
| 表达测试（额外收费） | RT-qPCR、WB、IF、FACS |
| 脱靶效应分析（额外收费） | NGS、PCR、Sanger测序 |
| 染色体分析（额外收费） | 核型分析 |
| 无菌测试（默认） | PCR检测支原体、生物负荷检测等 |
图2 CRISPR介导的iPSC基因敲入。通过电转法向iPSC中导入Cas9/gRNA RNP复合物和供体载体，成功敲入UBC驱动表达的EGFP（2432 bp）。（A）Sanger测序确认EGFP成功敲入靶位点。（B）基因型PCR分析四个敲入纯合子的单克隆。野生型（WT）靶点的长度为762 bp，敲入了EGFP的靶点的长度为3194 bp。（C）显微镜下的成功敲入的细胞具有EGFP荧光。（D）核型分析结果。（E）EGFP敲入的iPSC中多能性标记物（NANOG、OCT4和SOX2）的免疫荧光结果。
基因敲除依赖于非同源末端连接 (NHEJ) 介导的 CRISPR 引起的DNA双链断裂 (DSB) 修复，该机制容易出错，移码或片段删除（使用双 gRNA 时）等突变会以一定频率发生，导致目标基因功能丧失。另一方面，基因敲入则依赖于同源定向修复（HDR）机制，可将供体片段精确插入靶位点，其效率比NHEJ低，且仅限用于分裂细胞。此外，HDR效率也因细胞类型而异。因此，基因敲入在技术上比基因敲除更具挑战性。
选择供体模板的首要考虑因素是您的模板大小。对于小片段插入（<10 kb）,ssODN通常是最佳的选择，其HDR效率较高。对于大片段，可因情况选择使用线性dsDNA（细胞毒性较高，HDR率高）或者环状质粒载体（细胞耐受性好，HDR率低）。
药筛后获得阳性转导的混合细胞群。采用血细胞计数板等工具确定细胞数量和浓度。对细胞进行梯度稀释，然后在96孔板中培养，并使其浓度为<1 细胞/孔。单独的细胞克隆将被分离并扩增，对其进行基因型鉴定。
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