为什么我的荧光蛋白这么弱？

低到中等程度的抗性基因表达就能让细胞获得对药物的抗性。相反，荧光蛋白（FP）则需要高水平的表达才能获得明亮的荧光信号，较低或者中等程度的荧光表达会产生较弱的荧光信号，甚至会低于设备检测的最低临界值。此外，某些荧光蛋白（如EBFP）比常用荧光蛋白（如EGFP）更暗淡，特别难以检测。一些研究人员不得不使用抗荧光蛋白抗体，以可视化体外细胞培养或体内的荧光蛋白。以下是导致荧光不良的最常见原因：

弱启动子驱动荧光蛋白的表达

有一些启动子本身就比较弱（如UBC），只能驱动荧光蛋白的弱表达。有的启动子（如CMV）可以在体外细胞培养中很好地起作用，但有时在体内会沉默。当表达荧光蛋白时，您应该尽可能尝试使用一个强的广泛性启动子（如EF1A或CAG）。如果您必须使用组织特异性启动子，请尽可能选择一个表达能力强的；如果您必须使用弱或很弱的启动子，请为荧光蛋白信号不足的可能性做好准备。当这种情况发生时，这并不意味着您的荧光蛋白没有表达，它可能只是表达量不高。您可以使用更灵敏的检测方法，如RT-PCR或免疫荧光进行检测。

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在慢病毒和MMLV载体中表达荧光蛋白

对于逆转录病毒载体系统（慢病毒或者MMLV），聚腺苷酸化信号（poly A）不能存在于LTR之间，因为这会抑制病毒的包装。多聚腺苷酸化信号存在于3'LTR中，来自上游启动子的转录会经过上游ORF的末尾继续往下游的启动子和ORF转录，这会导致下游ORF的表达部分受到抑制。当下游ORF为荧光蛋白时，其表达会大大减少。您可以采取如下措施提高荧光蛋白的表达：

使用不同的载体系统，比如使用常规载体，腺病毒载体或腺相关病毒载体
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使用荧光更强的荧光蛋白变体（如TurboGFP代替EGFP）
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如果考虑在多顺反子的上游表达盒表达荧光蛋白，您可以使用2A linker连接目的基因和荧光蛋白基因。然而，这可能会影响多顺反子中其他ORF的生物学功能，也可能导致荧光蛋白表达较弱（见下文），且会增加载体构建的成本和时间。
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在多顺反子中表达荧光蛋白

当在多顺反子中表达荧光蛋白基因时，通常会存在以下所述问题，且有时荧光蛋白基因的表达与上游下游ORF有关。

荧光蛋白基因在IRES的下游
在包含一个或多个IRES元件的多顺反子中，与上游ORF相比，下游ORF表达水平比较低（通常为上游的10%-20%）。如果一个荧光蛋白在IRES的下游表达，则荧光会较弱。如果您必须在多顺反子的下游表达荧光蛋白，您可以考虑使用2A肽（如P2A或T2A），而不是IRES。通过使用2A肽，多顺反子下游ORF通常与上游ORF的表达量相当（或稍微低一点）。然而，2A肽也有缺陷，如可能会影响靶基因（GOI）的功能。当存在多个2A肽时，下游ORF倾向于以较低水平表达。另外，2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率会受上下游ORF序列的影响。因此，不能进行有效自我切割的融合蛋白将会是一种翻译产物，在某些实验运用中，这是一个值得注意的问题。需要特别注意的是2A肽的切割会在上游蛋白的C末端留下额外的短肽，并在下游蛋白的N末端留下额外的脯氨酸。在大多数实验应用中，这种情况不会产生不良影响，但是在某些情况下可能会影响蛋白功能。
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荧光蛋白是融合蛋白的一部分
融合蛋白几乎总是表现出比未融合蛋白较弱的荧光（比如EGFP/Neo融合蛋白的荧光比单独的EGFP荧光更弱）。此外，未经测试的融合蛋白可能存在胞内不稳定，错误折叠或无功能等问题。如果您怀疑这些是荧光弱的原因，可以尝试以下操作：