为什么我的shRNA对靶基因没有起到干扰作用？

并不是所有的shRNA都会起作用

根据我们的经验和来自客户的反馈，使用3-4个shRNA进行干扰测试时，通常只有2-3个有比较合理的干扰效果。所以，在使用shRNA时，重要的是要认识到并非所有的shRNA都能正常工作。通常情况下，约50-70％的shRNA具有干扰效果，其中只有约20-30％的shRNA具有比较明显的效果。如果您使用几个shRNA靶向同一个基因都没有一个能产生满意的干扰效果，最好的解决方式是尝试更多的shRNA，特别是那些经过文献验证的shRNA。目前，许多研究人员使用靶向相同基因的shRNA库（即不同shRNA的混合物）进行实验，以期提高干扰效率。

干扰效率检测方法不当

最常用评估shRNA干扰效率的灵敏测定方法是RT-qPCR，您可能需要尝试几对引物，筛选出最具特异性和效率的引物对。通常情况下，RT-qPCR引物应跨越内含子，即设计在两个外显子上，以免扩增基因组DNA。当使用新引物时，建议您先进行预扩增实验，并将PCR产物进行电泳检测目的条带，或者甚至可以通过测序验证PCR产物是否正确。在进行RT-qPCR的同时，应注意设置minus-RT对照以评估基因组DNA的污染水平。您可以使用NCBI引物设计工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）来检查引物质量。

干扰效率也可以通过蛋白质印迹法（Western blot）进行评估。然而，该方法常产生来自非特异性抗体结合的假阳性条带，从而导致误判没有干扰效果。因此，在使用时需要确保抗体的特异性。

您使用的shRNA可能只打靶基因的某个转录本

在设计shRNA时，我们推荐您使用那些能靶向单个基因多个转录本的shRNA，除非您只想打靶特定转录本。VectorBuilder提供针对常见物种的shRNA数据库。当您将shRNA元件插入载体时，您可以选择shRNA数据库，通过搜索目的基因查看所有可用的shRNA详细信息。您还可以打开其中的UCSC链接，查看shRNA序列在基因组和转录本中位置等信息。