预设计的shRNA文库

靶向性广和序列多样：针对人和小鼠，我们提供了两种规格的慢病毒shRNA文库产品：全基因组大库（针对约19,000个RefSeq基因）和精华基因小库（针对PubMed Central上约2,000个最常被引用的基因），每个基因对应5-6个不同的shRNA。shRNA靶点的设计规则参考RNAi consortium (TRC)，筛选出来的shRNA都具有较高的干扰分值，使得干扰效果更可靠，筛选效果更明显。

高度均一性： 通过NGS验证表明，精华库覆盖了100％的shRNA，全基因组库覆盖了97％的shRNA，每个shRNA出现的频率较均一（见图1）。

图1 shRNA在不同质粒DNA文库的均一性。shRNA读长分布按NGS文库大小（1000万reads）标准化，并以log2比例绘制。

体系成熟的慢病毒载体骨架和即用型高滴度慢病毒：shRNA文库使用的骨架是第三代慢病毒载体系统，利用人U6启动子介导shRNA的表达，这一系统能在多种细胞中高效稳定地干扰靶基因，而且可以永久有效并均一地将shRNA导入细胞，所以是体外遗传筛选的理想选择。我们可以提供以上文库的即用型慢病毒（>10⁸ TU/ml），可为您节省病毒包装和滴度测定时间。为了提高生物安全性，我们对第三代慢病毒载体系统进行了优化，使其不能进行自我复制。

图2 哺乳动物shRNA干扰慢病毒载体示意图

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含有双报告基因以利于筛选或追踪阳性细胞：构建文库使用的慢病毒载体骨架含有EGFP和嘌呤霉素抗性基因（Puro），可通过嘌呤霉素和绿色荧光示踪筛选阳性细胞。

图3 使用人类shRNA精华库（MOI = 10）转导293T细胞，利用嘌呤霉素筛选4天（1.5 μg/ml）之后，EGFP在293T细胞中的表达情况。放大倍数：200x。左：明场。右：GFP。

慢病毒shRNA文库介导的基因筛选常规流程如下图4所示。首先，利用慢病毒shRNA文库转导靶细胞，并通过慢病毒载体上携带的筛选标记（例如药物选择或荧光标记）来筛选成功转导的阳性细胞。将阳性细胞分为对照组和实验组，对实验组进行压力选择（如药物处理或重复传代），筛选出具有目的表型的细胞。基因功能筛选策略通常有三种类型：1）活力筛选，筛选出shRNA富集或锐减的活细胞; 2）报告基因筛选，筛选出报告基因的表达强度与shRNA的富集有关的细胞（如靶向调节报道基因表达shRNA）；3）行为筛选，筛选出shRNA与细胞侵袭、迁移等基因相关的细胞。相对于对照组，实验组细胞筛选完成后，通过sanger测序或NGS测序鉴定出富集或锐减的shRNA。通过下游功能研究，进一步分析富集或消减的shRNA可能靶向的候选基因。

图4 慢病毒shRNA文库介导的功能缺失筛选流程图，摘自Acta Biochim Biophys Sin 44：103-112 (2012)