为什么我的药物筛选标记不能让细胞产生抗性？

药物筛选基因通常只需要低至中等程度的表达即可有效，但也有例外。以下是细胞无抗药性的最常见原因：

使用的抗生素剂量过高

药物反应因细胞不同而异。在使用抗生素之前，建议您对细胞制作一个致死曲线（也称“剂量反应曲线”），摸索出能有效杀死未转染或转导细胞的最低药物浓度。即使细胞有抗药性基因，但过高的药物剂量也会导致细胞死亡，且还可能危害细胞的生长状态。某些细胞对某些药物极其敏感，这时您可能需要考虑更换另一种药物筛选标记。

了解常用抗生素工作浓度和药筛时间

弱启动子驱动药物筛选基因的表达

有一些启动子本身就比较弱（如UBC），只能驱动药物筛选基因的弱表达，您可以考虑使用一个强的广泛性启动子（如EF1A）。

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在慢病毒和MMLV载体中表达药物筛选基因

对于逆转录病毒载体系统（慢病毒或者MMLV），聚腺苷酸化信号（poly A）不能存在于LTR之间，因为这会抑制病毒的包装。多聚腺苷酸化信号存在于3'LTR中，来自上游启动子的转录会经过上游ORF的末尾继续往下游的启动子和ORF转录，这会导致下游ORF的表达部分受到抑制。当下游ORF为药物筛选基因时，其表达会大大减少。您可以采取如下措施提高荧光蛋白的表达：

• 使用不同的载体系统，比如使用常规载体，腺病毒载体或腺相关病毒载体

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• 如果考虑在多顺反子的上游表达盒表达药物筛选基因，您可以使用2A linker连接目的基因和药物筛选基因。然而，这可能会影响多顺反子中其他ORF的生物学功能，也可能导致药物筛选基因表达较弱，且会增加载体构建的成本和时间。

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药物筛选基因在IRES的下游

在包含一个或多个IRES元件的多顺反子中，与上游ORF相比，下游ORF表达水平比较低（通常为上游的10%-20%）。如果药物筛选基因在IRES的下游表达，则表达量会较低。如果您必须在多顺反子的下游表达药物筛选基因，您可以考虑使用2A肽（如P2A或T2A），而不是IRES。通过使用2A肽，多顺反子下游ORF通常与上游ORF的表达量相当（或稍微低一点）。然而，2A肽也有缺陷，如可能会影响靶基因（GOI）的功能。当存在多个2A肽时，下游ORF倾向于以较低水平表达。另外，2A肽的自我切割并不是100％有效的，其效率会受上下游ORF序列的影响。需要特别注意的是2A肽的切割会在上游蛋白的C末端留下额外的短肽，并在下游蛋白的N末端留下额外的脯氨酸。在大多数实验应用中，这种情况不会产生不良影响，但是在某些情况下可能会影响蛋白功能。

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