肌肉研究专用 AAV

肌肉是生物体内可自身收缩产生力并促使运动发生的组织。肌肉病变通常表现为肌肉萎缩、肌收缩力减弱以至消失。肌肉疾病的产生有先天和后天等因素，对于先天遗传缺陷的肌肉疾病，如杜兴氏肌肉营养不良症（Duchenne muscular dystrophy， DMD），传统药物只能减缓肌肉退化，但是医学界长期缺乏有效的治愈手段。基因治疗通过向肌肉直接导入有助肌肉功能恢复的基因拷贝，是一种具有相当吸引力的治疗策略。实际上，当前已有众多临床研究在探索肌肉疾病的基因治疗效果[1]。

AAV病毒载体是极具应用前景的基因给药工具。野生AAV被认为是非致病性的，感染个体后产生的免疫应答水平极低，无法自行复制，需依赖于与腺病毒或疱疹病毒的共同感染才能复制。 重组AAV载体自身只需携带一个顺式元件，ITR，就能生产出重组 AAV 颗粒。由于缺乏Rep基因，重组 AAV 病毒基因组不整 合宿主基因组，以染色体外形式长期存在，在非分裂细胞（如肌细胞）中也能实现治疗性蛋白的持久表达，安全性极高[2]。另外，多种血清型 AAV 对肌细胞具有良好嗜性。

载体家长期致力于高质量的 AAV 载体构建、AAV 病毒包装，旨在让您的研究更高效。

ssAAV vs. scAAV

与传统的单链（single-stranded，ss）基因组 AAV 载体相比，自我互补（self-complementary，sc）AAV 载体具有更高的转导效率和更快的转导动力学。ssAAV 载体通过宿主介导的 DNA 合成方式转化为活性的双链 DNA 形式。因此，双链 DNA 的 生成是 ssAAV 载体转导中的限制步骤。由于基因组只能使用一半，scAAV 适合作为小基因的载体[3]。载体家提供 ssAAV、scAAV 两种 AAV 载体构建以及病毒包装服务。

肌肉嗜性AAV血清型

载体家可提供多达 18 种 AAV 血清型：1-9、6.2、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF、 AAV2.7m8。

不同的血清型具有相似的结构和大小。然而，由于衣壳蛋白的结构不同，它们具有不同的嗜性。AAV 载体的某些血清型， 例如 AAV1、2、6、7、8、9，可有效转导骨骼肌细胞。直接肌肉注射 AAV 载体能产生局部高水平且持久的基因表达。此外，还可以通过静脉内递送一些 AAV 血清型，例如 AAV6、8 和 9，来实现全身肌肉细胞的转导[4, 5]。我们对小鼠骨骼肌进 行了 AAV1 和 AAV9 的转导测试，效果如图：

载体家测试 AAV1-CMV-EGFP 和 AAV9-CMV-EGFP 对小鼠肌肉的转导效果。取 6 周龄小鼠，尾静脉注射，注射剂量约 1.51 x 1011 vg/g。注射后 12 天后 处死取材，制备冰冻切片，激光共聚焦显微镜观察。

肌肉特异性启动子

载体家不仅提供广泛表达启动子，如CMV、EF1A、EFS、CAG、CBh等，当前还可以提供多种肌肉特异性启动子，帮助您 高效构建肌肉特异表达的 AAV 载体。

启动子名称描述组织噬性细胞噬性
MyogMouse myogenin promoterMuscleMyoblasts
ACTA1Human skeletal muscle actin α1 promoterMuscleMyocytes
MHCK7Composed of enhancer/promoter regions of murine muscle creatine kinase (MCK) and enhancer region of α-myosinheavy-chain genes.Mouse skeletal and heart musclesDifferentiated postmitotic striated muscle cells
SM22αMouse transgelin (a.k.a. Sm22α) promoterAdult smooth muscleVascular smooth muscle cells
EnSM22αThe chimeric vascular smoothmuscle-specific enhancer/promoter (The rabbit myosin heavy-chain enhancer inserted upstream of a truncated mouse SM22α promoter)Adult smooth muscleVascular smooth muscle cells
病毒递送方法

向肌肉组织递送 AAV 病毒载体通常分为局部的原位注射和系统性注射两大类。根据不同治疗目的，病毒载体的递送方法有差异。由于一般的肌肉疾病是全身性的，因此系统性注射是较好的策略。AAV8 和 AAV9 已被大量研究验证，在系统性注射后可以高效转导多种肌肉组织，如骨骼肌、心肌等。但是在一些需要利用肌肉组织分泌特定分子的治疗中，如分泌凝血因子VIII、IX，则直接进行肌肉注射。对于大块质量的肌肉组织，有时也采用逆行性经静脉肢体灌注的方法局部转导 AAV。关于肌肉的 AAV 病毒递送方式总结如下表[6]：

方法优点不足应用疾病
原位注射肌肉注射 Intramuscular injection
  • 易于注射
  • 高转导效率
  • 只对靶组织区域有效
  • 低免疫反应
转导区域无法覆盖大块肌肉组织α-1抗胰蛋白酶缺乏症、肢带型肌 营养不良症2D型、庞贝氏症等
经静脉肢体灌注 Transvenous limb perfusion杜兴氏肌肉营养不良症
冠状动脉内灌注Intracoronary infusion心力衰竭、心肌梗塞、肢带型肌营养不良
循环输送Recirculating delivery心力衰竭
心内膜注射 Transendocardial injection心力衰竭、杜兴氏肌肉营养不良症
系统性注射血管内注射 Intravascular injection能对大块肌肉组织乃至全身肌肉广泛转导注射后感染非靶组织需要很高的病毒载体剂量血清型选择较少面肩肱型肌营养不良症、心肌梗塞
腹腔注射 Intraperitoneal injection杜兴氏肌肉营养不良症、肢带型肌营养不良
肌肉组织结构

肌肉是许多动物体中重量最大的组织类型，具有驱动身体运动和保持身体姿势等功能。对于脊椎动物，肌肉分为骨骼肌（Skeletal muscle） 、平滑肌（Smooth muscle）和心肌（Cardiac muscle）三大类，其中骨骼肌是随意肌（Voluntary muscle） ，其收缩可受意识控制。平滑肌和心肌是不随意肌（Involuntary muscle） ，其收缩是自主发生的，不受意识控制。从外观上看，骨骼肌和心肌具有平行的纹理结构，因此也称为横纹肌（Striated muscle） 。从功能上看，骨骼肌附着 于骨骼上，可驱动身体运动。平滑肌分布于血管和除心脏外的内脏，有控制血管张力、负责肠道蠕动等多种功能。心肌是心脏节律性收缩的动力来源，让心脏具备推送血液至全身的能力[7]。

肌肉组织的收缩是肌细胞长度变化的结果。肌细胞由于其细长外形因此也称为肌纤维。在不同类型的肌肉中，肌纤维的形态和长度有较大差异。在横纹肌中，肌纤维中包含多个肌原纤维（Myofibril）结构。每个肌原纤维实质是由多个平行的肌丝组成的圆柱形结构，且包含较粗的和较细的两种肌丝。其中粗肌丝是主要由肌球蛋白（Myosin）分子构成的长轴，细肌丝则主要由肌动蛋白（Actin）组成。细肌丝结合于与其垂直的同样以肌动蛋白构成的 Z 线（Z-disk）, 而粗肌丝交错与细肌丝结合。在偏正光显微镜下，两个 Z 线构成的暗带之间形成一个明带，即肌节（Sarcomere）。肌节在光学显微镜下呈现为横纹肌的纹理结构。对于骨骼肌，当肌肉接受到沿神经传递的动作电位后，肌细胞发生钙离子内流，然后经一系列分子相互作用引发粗肌丝与细肌丝之间相互滑行。肌丝的牵引作用导致肌节变短，最终产生肌肉收缩现象[8]。

References

[1] Asher DR, Thapa K, Dharia SD, Khan N, Potter RA, Rodino-Klapac LR, Mendell JR. Clinical development on the frontier: gene therapy for duchenne muscular dystrophy. Expert Opin Biol Ther. 2020 Mar;20(3):263-274.

[2] Chamberlain K, Riyad JM, Weber T. Cardiac gene therapy with adeno-associaed virus-based vectors. Curr Opin Cardiol. 2017 May;32(3):275-282.

[3] Katz MG, Fargnoli AS, Weber T, Hajjar RJ, Bridges CR. Use ofAdeno-Associated Virus Vector for Cardiac Gene Delivery in Large-Animal Surgical Models of Heart Failure. Hum Gene Ther Clin Dev. 2017 Sep;28(3):157-164.

[4] Qiao C, Koo T, Li J, Xiao X, Dickson JG. Gene therapy in skeletal muscle mediated by adeno-associated virus vectors. Methods Mol Biol. 2011;807:119-40.

[5] Duan D. Systemic AAV Micro-dystrophin Gene Therapy for Duchenne Muscular Dystrophy. Mol Ther. 2018 Oct 3;26(10):2337-2356.

[6] Wang D, Zhong L, Nahid MA, Gao G. The potential of adeno-associated viral vectors for gene delivery to muscle tissue. Expert Opin Drug Deliv. 2014 Mar;11(3):345-364.

[7] Muscle. (n.d.). https://www.britannica.com/science/muscle.

[8] Muscular. IMHOTEP VIRTUAL MEDICAL SCHOOL. (2014, May 14). https://drimhotepmd.wordpress.com/muscular.

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