肝脏研究专用 AAV

肝脏是人体中参与许多物质代谢和排毒的主要器官。多种代谢紊乱是肝起源的。由单一基因突变引起的遗传性和获得性代谢疾病多达几百种，对于其中许多而言，原位肝移植是唯一已知的治疗方法。考虑到许多这些疾病的单基因性质，基因治疗方法似乎自然适用于治疗^[1]基因治疗能够将基因的正常拷贝放入细胞，从而改变细胞的工作方式，达到治愈目的。为了将基因插入细胞，基因疗法使用载体将基因放入细胞。

AAV 病毒载体是极具应用前景的基因给药工具。野生 AAV 被认为是非致病性的，感染个体后产生的免疫应答水平极低，无法自行复制，需依赖于与腺病毒或疱疹病毒的共同感染才能复制。

重组 AAV 载体自身只需携带一个顺式元件，ITR，就能生产出重组 AAV 颗粒。由于缺乏 Rep 基因，重组 AAV 病毒基因组不整合宿主基因组，以染色体外形式长期存在，在非分裂细胞（如默认状态下的肝细胞）中也能实现治疗性蛋白的持久表达，安全性极高^[2]。另外，多种血清型AAV对肝细胞具有良好嗜性

载体家长期致力于高质量的 AAV 载体构建、AAV 病毒包装，旨在让您的研究更高效。

ssAAV vs. scAAV

与传统的单链（single-stranded，ss）基因组 AAV 载体相比，自我互补（self-complementary，sc）AAV 载体具有更高的转导效率和更快的转导动力学。ssAAV 载体通过宿主介导的 DNA 合成方式转化为活性的双链 DNA 形式。因此，双链 DNA 的生成是 ssAAV 载体转导中的限制步骤。由于基因组只能使用一半，scAAV 适合作为小基因的载体 [3] 。载体家提供 ssAAV、scAAV 两种 AAV 载体构建以及病毒包装服务。

肝脏嗜性AAV血清型

载体家可提供多达 18 种 AAV 血清型：1-9、6.2、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF、AAV2.7m8。

不同的血清型具有相似的结构和大小。然而，由于衣壳蛋白的结构不同，它们具有不同的嗜性。AAV2 首先被报道在小鼠体内实施静脉注射后具肝嗜性。随后，9 种常用的 AAV 血清型载体（AAV1-9、rh10）在小鼠体内被证实具有肝嗜性，其中 AAV8 转导效率非常高。后来临床试验证实 rAAV2 和 rAAV8 转导人肝细胞无效。AAV3 虽然在小鼠体内不具有肝嗜性，但被报道可以有效地转导体外培养的人肝癌细胞和原代人肝细胞，和体内转导非人灵长类动物的肝细胞 [3] 。我们对 AAV9进行了肝脏转导测试，效果如图：

载体家测试 AAV9-CAG-EGFP 转导小鼠肝脏效果。取 6 周龄小鼠，尾静脉注射，注射剂量约 6 x 10¹¹ vg/g。10 天后处死取材，制备冰冻切片，激光共聚焦显微镜观察。

肝脏特异性启动子

载体家不仅提供广泛表达启动子，如 CMV、EF1A、EFS、CAG、CBh 等，还可以提供多种肝脏特异性启动子，帮助您高效构建肝脏特异表达的 AAV 载体。

启动子名称	描述	组织噬性	细胞噬性
Afp	Mouse α-fetoprotein enhancer II fused with human beta globin promoter	Liver	Hepatocytes
Alb	Mouse albumin promoter	Liver	Mature hepatocytes
TBG	Human thyroxine-binding globulin promoter	Liver	Hepatocytes

病毒递送方法

向肝脏递送 AAV 病毒载体可以分为肝脏直接递送（Direct liver delivery）和外周载体递送（Peripheral vector delivery）两大类。早期动物研究使用的 AAV2 受制于血清型感染效率问题，理想的转导方式是肝脏直接注射。后续发现 AAV8、AAV9 等肝脏噬性更强的血清型后，从外周注射也能满足高转导效率的要求。在人的 AAV 基因治疗临床试验中，一般从手臂静脉注射病毒载体。不同递送方式的对比如下表^[4，5]。

	方法	优点	不足	应用物种
肝脏直接递送	肝叶注射Liver lobes injection	转导效率高	高侵入性、操作复杂、有凝血缺陷的动物具有术后并发症风险	Mouse
	肝门静脉注射Portal vein injection（PV）			Rat、Dog、NHP
	脾被膜注射Splenic capsule injection			Mouse
	肝动脉注射Hepatic artery injection（HA）			NHP
外周载体递送	腹腔注射Intraperitoneal injection（IP）	侵入性小、易操作	应用于中大型动物时被稀释	Mouse
外周载体递送	血管内注射Intravenous injection（IV）	侵入性小、易操作	注射体积较IP更为受限	Mouse、Dog、NHP、Human

肝脏结构

肝脏从整体结构上来看主要是由肝叶构成的，包含左肝叶（Left lobe）和右肝叶（Right lobe）。每个肝叶由 8 个区块组成，每个区块包含 1000 个肝小叶（Hepatic lobule）。肝小叶是实现肝脏功能的基本结构单位，为柱状多面体，主要由肝细胞组成的肝板（Hepatic plate）、中央静脉（Central vein）、肝血窦（Sinusoid）以及毛细胆管（Bile canaliculus）等微小结构组成。肝脏功能众多，可以产生胆汁、代谢脂肪、糖原贮存和血液过滤等，是重要的代谢器官。由于肝脏的重要性，当肝脏缺损时，肝细胞可以再次分裂增殖，肝脏是唯一可以自我再生的内部器官^[6]。

肝脏具有双重的血液供给：一方面通过肝门静脉（Portal vein）汇集来自脾静脉（Splenic vein）和肠系膜上静脉（Superior mesenteric vein）等经过多个消化器官的含营养物质的血液，另一方面通过肝动脉（Hepatic artery）接受来自心脏的含氧血液。肝门静脉和肝动脉进入肝脏后即辐射出大量的门静脉分支和肝动脉分支。血液从这些分支的血管进入肝小叶，混合并流经肝血窦，然后进入肝小叶中心的中央静脉，最后随肝静脉排出肝脏^{[6, 7]}。

肝血窦实质是一种特化的毛细血管。血窦壁与一般毛细血管壁不同，血窦壁内皮细胞排列疏松，且细胞上具有窗孔（Fenestrae），细胞外无连续的基膜（Basement membrane）覆盖。这些结构导致大分子可以随血浆穿过血窦壁进入血窦和肝细胞之间的空隙⸺窦周隙（Space of Disse），而同时红细胞和血小板被阻隔。肝细胞表面的微绒毛结构也伸入窦周隙中，窦周隙因此是肝细胞和血浆进行物质交换的场所^[8]。

鉴于以上的结构特点，肝脏非常有利于使用系统性注射的方式进行 AAV 转导。首先体内大量的血液经门静脉和肝动脉进入肝脏：一个成年人的肝脏每分钟可通过约 1 L 的血流量，占全身用血比例的 10-15%。此外血窦壁的高通透性也允许病毒颗粒经血浆直接接触肝细胞，有利于获得高的感染效率^[9]。

References

[1] Moscoso CG, Steer CJ. The Evolution of Gene Therapy in the Treatment of Metabolic Liver Diseases. Genes (Basel). 2020 Aug 10;11(8):915.

[2] Chamberlain K, Riyad JM, Weber T. Cardiac gene therapy with adeno-associaed virus-based vectors. Curr Opin Cardiol. 2017 May;32(3):275-282.

[3] Berns KI, Srivastava A. Next Generation ofAdeno-Associated Virus Vectors for Gene Therapy for Human Liver Diseases. Gastroenterol Clin North Am. 2019 Jun;48(2):319-330.

[4] Moscoso CG, Steer CJ. The Evolution of Gene Therapy in the Treatment of Metabolic Liver Diseases. Genes (Basel). 2020 Aug 10;11(8):915.

[5] Palaschak B, Herzog RW, Markusic DM. AAV-Mediated Gene Delivery to the Liver: Overview of Current Technolo- gies and Methods. Methods Mol Biol. 2019;1950:333-360.

[6] Venous Drainage of the Abdomen. teachmeanatomy.info/abdomen/vasculature/venous-drainage/.

[7]“The Liver: Structure, Function, and Disease.”Medical News Today, MediLexicon International, www.medical- newstoday.com/articles/305075#regeneration.

[8] Paxton, Steve, et al.“The Leeds Histology Guide.”Home: The Histology Guide, 1 Jan. 1970, www.histolo-gy.leeds.ac.uk/digestive/liver_hepatocyte.php.

[9] Kattenhorn LM, Tipper CH, Stoica L, Geraghty DS, Wright TL, Clark KR, Wadsworth SC. Adeno-Associated Virus Gene Therapy for Liver Disease. Hum Gene Ther. 2016 Dec;27(12):947-961.

病毒指南