线虫Cas9表达载体

概述

CRISPR/Cas9（成簇规则间隔短回文重复序列/CRISPR相关蛋白9）系统极大地促进了多种物种的体外和体内基因抑制实验。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用提供靶向特异性。gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。Cas9扫描基因组并切割与gRNA互补的序列，前提是这些序列跟随着一段NGG前间区序列邻近基序（PAM）。双链DNA断裂随后被HDR或者NHEJ途径修复，从而产生不同大小长度的位点突变（碱基插入或缺失）。

使用一个一体化的同时表达Cas9和gRNA的载体，或者分开表达Cas9和gRNA的载体，可以方便地在线虫中进行CRISPR/Cas9编辑。该载体系统属于后者，包含一个线虫密码子优化的Cas9基因。该基因位于一个可加强表达的人工启动子下游，并以一个包含polyA加尾信号序列的3’ UTR结尾。该载体系统可选择广泛性启动子（eft-3 和pie-1）、组织特异性启动子（spe-11、myo-2、myo-3和rab-3）、以及诱导型启动子（hsp16-2和hsp16-48）。

该载体可以被注射到线虫的远端性腺，然后进入生殖细胞细胞核。筛选突变后代，获得突变可遗传的基因敲除线虫品系。该载体也可以单独使用。注射线虫性腺生产Cas9表达的线虫品系。

关于该载体系统的更新信息，请参考以下文献。

参考文献	主题
Genetics. 202:885 (2016)	DNA transformation in C. elegans
Curr Protoc Mol Biol. 129 (2019)	CRISPR/Cas9 vectors in C. elegans
Nat Methods. 10:741 (2013)	gRNA design for C. elegans

亮点

我们的线虫Cas9表达载体经过优化，在大肠杆菌中具有高拷贝复制能力，且对细胞具有高效转染率。该载体表达的Cas9与gRNA结合后，可以在线虫中有效地实现基因编辑

优势

技术简单：使用显微注射即可把质粒转入细胞，相比起病毒载体需要进行病毒包装，过程更简单。.

突变可遗传：通过CRISPR/Cas9系统在生殖细胞进行基因编辑，可以获得稳定的突变可遗传的线虫品系。

不足之处

基因拷贝数在不同细胞中呈现差异性：尽管成功的转染可以在单个细胞里产生非常高的拷贝数，但不同细胞间却有高度的差异性。在一些细胞中，质粒拷贝数非常高，而在另外一些细胞却是低拷贝甚至没有。

PAM要求：CRISPR/Cas9靶位点必须包含NGG序列（使用较多），也叫做PAM序列，位于gRNA识别序列3'末端。

关键元件

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Synthetic intron: This is placed proximal to the promoter to enhance gene expression.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest, e.g. C. elegans codon-optimized Cas9 (CeCas9), is placed here.

unc-54 3’ UTR+polyA: Myosin-4 3’ UTR with downstream polyA from C. elegans. It allows transcription termination and polyadenylation of mRNA transcribed by Pol II RNA polymerase.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

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