无肠腺病毒基因表达载体

无肠腺病毒载体（又称辅助依赖性腺病毒载体）是比前几代腺病毒载体显著改进安全性的新一代腺病毒载体。这种载体上除了病毒复制和包装所必需的顺式作用元件外，几乎不含任何病毒序列，使得无肠腺病毒载体在体内使用时表现出极低的免疫原性和长期的转基因表达，在应用于基因治疗方面具有高度的有吸引力。此外，由于删除了病毒编码序列，该种载体的装载容量可增加至37 kb，使其可以表达大尺寸或多个的转基因。

由于无肠腺病毒载体缺乏所有病毒编码序列，成功包装重组病毒所需的病毒蛋白通过包装时的辅助病毒提供。对于无肠腺病毒载体，包含用户目的基因（GOI）的表达盒由启动子驱动，并且被克隆到两个ITR（反向重复序列）之间。此外，该载体还加入了适当长度的填充序列，以保持两个ITR之间的序列最终大小超过28 kb，这对于促进病毒颗粒的高效包装是必要的。包装时，载体上的两个ITR之前的区域通过限制性内切酶消化从质粒中释放出来。释放的片段被转染到包装细胞中，这些细胞随后通过转导辅助病毒以产生重组腺病毒颗粒。

我们的无肠腺病毒载体系统需要利用到一个包装信号位于两个LoxP位点之间的辅助病毒，以及稳定表达Cre重组酶的包装细胞。在包装细胞中这个辅助病毒基因组上的包装信号发生Cre介导的切除，因此可以防止辅助病毒基因组与无肠腺病毒基因组一同被包装进病毒颗粒中。当使用无肠腺病毒转导靶细胞时，其DNA基因组被送入细胞中，并进入细胞核以不整合宿主基因组的游离体DNA形式存在。在载体克隆过程中放置在两个ITR之间的任何序列会被引入靶细胞。

关于该载体的更多信息，请参照以下的参考文献。

我们的无肠腺病毒使用Ad5血清型。该种血清型的腺病毒已被证明具有高滴度、高转导效率以及良好的转基因表达量。

高安全性：为了确保腺病毒载体的生物安全性，我们的无肠腺病毒载体缺失了病毒的编码序列，只具有病毒复制和包装所需的反式作用元件，因此相对于前代腺病毒载体具有更高的安全性。该种载体因此最小化了宿主免疫反应，并且具有更长的体内转基因表达时间。

对宿主基因组造成破坏的低风险性：在转导进入靶细胞后，腺病毒载体在细胞核保持着游离DNA的状态，可以降低宿主基因组被破坏而致癌的风险，使其成为人类体内实验的理想载体。

高病毒滴度： 无肠腺病毒可通过再次转导包装细胞而得到大量扩增，从而获得超高滴度病毒，慢病毒载体、逆转录病毒载体和AAV载体都不具有这个特性。我们提供的无肠腺病毒滴度可以达到>10¹⁰ IFU/ml。

组织嗜性广： 来源于人、小鼠和大鼠等常用哺乳动物细胞都能被腺病毒载体转导，但某些细胞类型则比较难转导（见下文不足之处）。

载体容量大： 无肠腺病毒载体由于删除了病毒编码序列，其装载量可达37 kb，可以表达很大的或者多个转基因。

体内外实验均有效： 我们的载体不仅能用于体内活体动物实验，还具有体外细胞转导能力。

载体DNA非整合型：无肠腺病毒基因组不会整合到靶细胞的基因组中，而是以游离DNA的形式存在，并且随着时间推移逐渐丢失，特别是在分裂细胞中。

难以转导特定类型的细胞：虽然我们的无肠腺病毒可以转导很多类型的细胞包括非分裂细胞，但对某些特定类型的细胞如内皮细胞、平滑肌细胞、呼吸上皮分化细胞、外周血细胞、神经元和造血干细胞等，却无法进行有效的转导。

辅助病毒污染：我们的无肠腺病毒载体系统在包装时需要利用一种包含floxed包装信号的辅助病毒，以及稳定表达Cre重组酶的包装细胞。Cre重组酶可以介导辅助病毒包装信号的切除，限制辅助病毒基因组无肠腺病毒基因组一同被包装入病毒颗粒中。然而而，由于包装信号切除效率的限制，重组病毒原液中可能仍存在低水平的辅助病毒成分污染。 

技术复杂：无肠腺病毒载体包装时需要引入辅助病毒，相比普通腺病毒包装技术难度更高。

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Ad5_E4 fragment: Adenovirus serotype 5 E4 gene promoter region. Can improve vector stability and supports packaging.

Promoter: The promoter that drives your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

hPGK promoter: Human phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression the downstream marker gene.

Marker: A visually detectable gene (such as EGFP). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

TK pA: Herpes simplex virus thymidine kinase polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

C346_Stuffer: Part of C346 cosmid (GenBank L31948) DNA sequence. Used for maintaining a final size above 28 kb between the two ITRs of vectors to facilitate efficient packaging into virions.

HPRT_Stuffer: Part of human hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase (HPRT1) DNA sequence (containing introns 1, 2 and 3 and exon 2, 3). Used for maintaining a final size above 28 kb between the two ITRs of vectors to facilitate efficient packaging into virions.

Ψ: Adenovirus packaging signal required for the packaging of viral DNA into virus.

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. See description for 3’ ITR.

Kanamycin: Kanamycin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by kanamycin selection in E. coli.

pBR322 ori: pBR322 origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in medium copy numbers in E. coli.