哺乳动物基因表达Tol2载体

概述

我们的Tol2载体系统能高效地将外源DNA插入宿主细胞基因组中。该系统技术简单，利用质粒转染（非病毒转导）将目的基因永久整合到宿主基因组中。

该系统来源于Tol2转座子，它最初是从硬骨鱼青鳉鱼（Oryzias latipes）中分离出来的。基于序列同源性分析，发现Tol2转座子与整个脊椎动物基因组中发现的非自主元件的hAT家族密切相关。

Tol2系统包含两个载体，一个载体被称为辅助质粒，负责编码转座酶；另一个载体被称为转座子质粒，包含两个反向末端重复序列（ITRs）以及两者之间的转座区域，需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。

Tol2系统包含两个组分，一个组分是Tol2转座酶（通常为表达Tol2转座酶的IVT mRNA）。另一个组分为转座子载体，包含两个反向末端重复序列（ITR）以及两者之间的转座区域，需要被转座到宿主基因组中的目的基因就克隆在这个区域。

表达Tol2转座酶的IVT mRNA和转座子载体共转染至靶细胞时，IVT mRNA产生的转座酶将会识别转座子的两个ITR，然后将被转座区和两个ITR元件插入到宿主基因组中。Tol2转座子在宿主细胞中的插入位点没有明显碱基偏好性，这不同于具有特定靶标位点的转座子系统。如，piggyBac转座插入通常发生在包含TTAA序列的宿主染色体位点。

Tol2是II类转座子，通过“剪切—粘贴”的机制移动，从一个地方转座到另一个地方，而不留下序列本身（恰好相反，I类转座子是通过“复制—粘贴”的方式移动）。Tol2通过“剪切-粘贴”机制以单拷贝进行整合，在每一个插入位点都会产生一个8 bp的重复序列。

有两种途径可将转座酶导入靶细胞。第一种是将辅助质粒瞬时转染到细胞中，使转座酶的瞬时表达。第二种是利用辅助质粒体外转录出Tol2 mRNA，然后注射到靶细胞中。无论哪种情况，转座酶都只能短时间表达。随着辅助质粒的丢失或转座酶mRNA的降解，转座子会永久整合到宿主基因组中。如果将Tol2转座酶重新导入细胞中，整合的转座子会再次通过“剪切—粘贴”的机制移动。

关于该载体系统的更多资料，请参考以下文献。

参考文献	主题
Genome Biol. 8(Suppl 1): S7 (2007)	Review of Tol2 vectors
Genetics 174: 639–649 (2006)	Identification of minimal sequences for Tol2 transposable elements
PLoS Genetics 2: e169 (2006)	Large cargo-capacity transposition with a minimal Tol2 transposon

亮点

Tol2转座子载体系统可将高达11 kb的序列有效插入到靶细胞基因组中。我们的Tol2转座子载体与辅助质粒是经过优化的，可在大肠杆菌中高拷贝复制。该载体系统对多种类型的靶细胞均具有高效的转导效率，实现外源基因的高水平表达。

优势

外源基因的永久整合：常规质粒转染只能实现外源基因的瞬时表达，这种外源基因会随着宿主细胞的分裂而不断丢失，在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反，将Tol2转座子载体和辅助质粒（或者Tol2 mRNA）一起转染到哺乳动物细胞中，由于转座子在转座酶的作用下，目的基因能稳定地整合到宿主细胞的染色体中，从而实现转座子载体上携带的目的基因在宿主细胞中永久表达。

技术简单：通过常规转染即可把质粒转入细胞，相比起病毒载体需要进行病毒包装，过程更简单。

载体容量大：我们的转座子载体总容量可达11 kb，其中质粒骨架只占3 kb，有足够大的容量可以放置客户所感兴趣的序列。

不足之处

转染细胞类型受限：Tol2载体进入细胞依赖于转染。不同类型的细胞，其转染效率差异非常大。非分裂细胞通常比分裂细胞更难转染，原代细胞比永生化细胞更难转染，一些重要的细胞类型转染难度更大，如神经元和胰岛β细胞。另外，质粒转染主要局限于体外应用，很少应用于体内实验（但可以应用于转基因动物模型制备）。以上因素在一定程度上制约了Tol2系统的应用。

载体关键元件

5' ITR: Tol2 5' terminal repeat. When a DNA sequence is flanked by two ITRs, the Tol2 transposase can recognize them, and insert the flanked region including the two ITRs into the host genome.

Promoter: The promoter driving your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: Tol2 3' terminal repeat.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Representative vector design

VB ID	Vector name	Descriptions
VB010000-9312gvc	pTol2[Exp]-CMV>EGFP/Puro	A Tol2 transposon gene expression vector encoding an EGFP: puromycin resistance fusion protein driven by a CMV promoter.
VB231214-1676xns	pTol2[Exp]-CAG>hSOD1[NM_000454.5]	A Tol2 transposon vector expressing CAG-driven human superoxide dismutase, which is responsible for breaking down toxic superoxide radicals.
VB010000-9367csj	pRP[Exp]-CAG>Tol2 transposase	A mammalian gene expression vector encoding Tol2 transposase.

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