哺乳动物Cas9表达质粒载体

CRISPR/Cas9核酸酶表达载体是当前几种流行的基因编辑工具之一，可以快速有效地在基因组靶序列上创造突变（其它两种常见的工具是ZFN和TALEN）。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。

使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA，也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合（如Cas9n，dCas9），从而带来更多变的实验方案。

我们的常规Cas9表达质粒载体可以直接转染哺乳动物细胞，方法如同大多数实验室的传统转染方法一样，操作上非常简便。质粒转染要注意的是，这种方法属于瞬时转染，只有极小一部分的细胞中的质粒序列会稳定整合到细胞基因组中（整合几率的典型值小于1%）。

我们提供多种版本的来源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。这其中包括hCas9，人源化的野生型SpCas9，能有效地在靶序列制造DNA双链断裂（DSB）；hCas9-DA10，核酸酶突变型的人源hCas9，只对靶序列的DNA单链造成切口；dCas9，包含D10A和H840A突变，属于无核酸酶活性的SpCas9；SpCas9-HF1，亲和性强化的SpCas9；以及eSpCas9，特异性强化的SpCas9。dCas9融合转录激活结构域如dCas9/VP64和dCas9/VPR，或者融合转录抑制结构域后，如dCas9/KRAB，可分别应用于CRISPRa和CRISPRi系统。此外，我们提供的来源于Staphylococcus aureus的SaCas9，其序列要比SpCas9和来源于Acidaminococcus的AsCpf1更短（AsCpf1属于新一代CRISPR基因编辑系统。AsCpf1造成DSB时，两条DNA链上的切口位置相互错开，形成粘性末端）。

点击此处查看我们提供的Cas9类型

关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。

我们的Cas9表达载体可使用用户自定义的启动子实现Cas9蛋白的高水平表达。我们提供多种类型的Cas9蛋白以满足不同的实验需求。Cas9表达载体系统已经过优化，其在大肠杆菌中具有高拷贝复制能力，且对细胞具有高效转染率。根据用户选择的筛选标记基因，可对转染了该载体的细胞进行筛选或者可视化追踪。

瞬时表达：转染Cas9表达质粒载体可以在靶细胞中获得高水平的Cas9蛋白表达瞬时峰值。在无药筛的情况下，基因编辑完成后Cas9质粒载体会逐渐从细胞中丢失。

灵活性：Cas9表达质粒载体可与多种不同的gRNA共转染至细胞中以打靶多个位点。

技术简单：常规转染即可把质粒转入细胞，相比起病毒载体需要进行病毒包装，过程更简单。

高水平表达：常规质粒转染细胞后，可以产生非常高的拷贝数（每个细胞多达几千拷贝），使外源基因能高水平表达。

载体DNA非整合型：常规质粒在细胞里主要以游离DNA状态存在，所以常规质粒转染也称为瞬时转染。然而，质粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因组中（质粒转染每10²~10⁶个细胞可能会有一个细胞的基因组被整合，整合效率取决于细胞类型）。如果将携带了药物抗性基因或者荧光标记基因的载体转到细胞中，在经过扩大和传代培养后，可以使用药物筛选或细胞分选来获得稳定整合了该载体的细胞。

可转染的细胞类型受限：不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染，原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染，如神经元和胰岛β细胞。另外，质粒转染局限于体外细胞实验，很少运用到活体实验。

基因拷贝数在不同细胞中呈现差异性：尽管成功的转染可以在单个细胞里产生非常高的拷贝数，但不同细胞间却有高度的差异性。在一些细胞中，质粒拷贝数非常高，而在另外一些细胞却是低拷贝甚至没有。而病毒转导更倾向于相对均匀地把基因转到细胞中。

PAM序列依赖: CRISPR/Cas9靶向特定位点时对gRNA识别序列3'端的PAM序列有严格要求。不同类型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

CRISPR/Cas9核酸酶表达载体是当前几种流行的基因编辑工具之一，可以快速有效地在基因组靶序列上创造突变（其它两种常见的工具是ZFN和TALEN）。

Cas9是RNA引导DNA核酸酶，是天然原核免疫系统的一部分，赋予细菌产生对质粒和噬菌体等外源遗传物质的抵抗能力。在细胞内，Cas9核酸酶与引导RNA（gRNA）形成复合物，该复合物通过与基因组中的18-22 nt的同源靶序列直接相互作用，gRNA与靶位点通过互补配对使Cas9定位到靶序列上，然后切割基因组中的靶位点。

使用CRISPR打靶目的基因需要目标细胞同时表达Cas9和特异gRNA。这可以通过在同一个载体上共表达Cas9和gRNA，也可以通过在两个载体各上自表达Cas9和gRNA来实现。使用Cas9和gRNA两个载体分开表达的优势在于可使用不同的gRNA与不同的Cas9变体组合（如Cas9n，dCas9），从而带来更多变的实验方案。

我们的常规Cas9表达质粒载体可以直接转染哺乳动物细胞，方法如同大多数实验室的传统转染方法一样，操作上非常简便。质粒转染要注意的是，这种方法属于瞬时转染，只有极小一部分的细胞中的质粒序列会稳定整合到细胞基因组中（整合几率的典型值小于1%）。

我们提供多种版本的来源于Streptococcus pyogenes的SpCas9。这其中包括hCas9，人源化的野生型SpCas9，能有效地在靶序列制造DNA双链断裂（DSB）；hCas9-DA10，核酸酶突变型的人源hCas9，只对靶序列的DNA单链造成切口；dCas9，bao'hanD10A和H840A突变，属于无核酸酶活性的SpCas9；SpCas9-HF1，亲和性强化的SpCas9；以及eSpCas9，特异性强化的SpCas9。dCas9融合转录激活结构域如dCas9/VP64和dCas9/VPR，或者融合转录抑制结构域后，如dCas9/KRAB，可分别应用于CRISPRa和CRISPRi系统。此外，我们提供的来源于Staphylococcus aureus的SaCas9，其序列要比SpCas9和来源于Acidaminococcus的AsCpf1更短（AsCpf1属于新一代CRISPR基因编辑系统。AsCpf1造成DSB时，两条DNA链上的切口位置相互错开，形成粘性末端）。

点击此处查看我们提供的Cas9类型

关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。

我们的Cas9表达载体可使用用户自定义的启动子实现Cas9蛋白的高水平表达。我们提供多种类型的Cas9蛋白以满足不同的实验需求。Cas9表达载体系统已经过优化，其在大肠杆菌中具有高拷贝复制能力，且对细胞具有高效转染率。根据用户选择的筛选标记基因，可对转染了该载体的细胞进行筛选或者可视化追踪。

瞬时表达：转染Cas9表达质粒载体可以在靶细胞中获得高水平的Cas9蛋白表达瞬时峰值。在无药筛的情况下，基因编辑完成后Cas9质粒载体会逐渐从细胞中丢失。

灵活性：Cas9表达质粒载体可与多种不同的gRNA共转染至细胞中以打靶多个位点。

技术简单：常规转染即可把质粒转入细胞，相比起病毒载体需要进行病毒包装，过程更简单。

高水平表达：常规质粒转染细胞后，可以产生非常高的拷贝数（每个细胞多达几千拷贝），使外源基因能高水平表达。

载体DNA非整合型：常规质粒在细胞里主要以游离DNA状态存在，所以常规质粒转染也称为瞬时转染。然而，质粒DNA也可以以非常低的概率永久整合到宿主基因组中（质粒转染每10²~10⁶个细胞可能会有一个细胞的基因组被整合，整合效率取决于细胞类型）。如果将携带了药物抗性基因或者荧光标记基因的载体转到细胞中，在经过扩大和传代培养后，可以使用药物筛选或细胞分选来获得稳定整合了该载体的细胞。

可转染的细胞类型受限：不同类型细胞的质粒转染效率差异很大。非分裂细胞比分裂细胞更难转染，原代细胞比永生化细胞系更难转染。一些重要的细胞类型更是难以转染，如神经元和胰岛β细胞。另外，质粒转染局限于体外细胞实验，很少运用到活体实验。

基因拷贝数在不同细胞中呈现差异性：尽管成功的转染可以在单个细胞里产生非常高的拷贝数，但不同细胞间却有高度的差异性。在一些细胞中，质粒拷贝数非常高，而在另外一些细胞却是低拷贝甚至没有。而病毒转导更倾向于相对均匀地把基因转到细胞中。

PAM序列依赖: CRISPR/Cas9靶向特定位点时对gRNA识别序列3'端的PAM序列有严格要求。不同类型的Cas9蛋白需要使用不同的PAM序列。

Promoter: The promoter that drives the expression of the downstream Cas9 gene is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of the Cas9 nuclease variant chosen by the user.

SV40 late pA: Simian virus 40 late polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives the ubiquitous expression of the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.