哺乳动物CAR表达慢病毒载体

利用嵌合抗原受体 (Chimeric antigen receptor，CAR) 载体生产可识别肿瘤相关抗原的工程T细胞（也称为CAR T细胞）已成为一种极富前景的癌症治疗工具。在 CAR T细胞免疫疗法中，来自患者（自体）或健康供体（同种异体）的T细胞经过改造表达CAR。CAR受体可以靶向识别肿瘤细胞表面抗原，活化T细胞使其发挥免疫作用以帮助杀伤肿瘤细胞。

CAR受体的结构由四个主要部分组成：（1）一个胞外抗原识别结构域，由已知特异性的抗体的单链可变区片段 (Single chain variable fragment，scFv) 组成。 scFv促进抗原结合，包含一个轻链可变区片段和一个特异的单克隆抗体的重链片段，两者通过一个柔性的肽链相连；（2）一个位于胞外的铰链区或间隔区，将scFv与CAR的跨膜结构域连接起来，并为CAR的结构提供灵活性和稳定性；（3）跨膜结构域，将 CAR 锚定在质膜上，从而将胞外的铰链区和抗原结合结构域同细胞内结构域关联起来。它在增强受体表达和稳定性方面起着关键作用；（4）胞内信号域，通常源自T细胞受体的CD3 zeta 链并包含免疫受体酪氨酸激活基序（Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)。抗原结合CAR后，ITAM被磷酸化并激活下游信号传导，从而导致T细胞的后续活化。此外，该胞内结构域还可以引入一个或多个与CD3 zeta信号域串联的共刺激域（来源于CD28、CD137等），以改善T细胞增殖效率和活化的持久性。

CAR的结构在过去几年中随着对胞内结构域的修改而不断发展。第一代CAR仅包含一个衍生于CD3 zeta链的信号域。虽然这种CAR可以激活T细胞，但是由于表达此类CAR的T细胞的细胞毒性和增殖能力偏低，它们在体内的抗肿瘤活性并不理想。第二代CAR除了包含一个CD3 zeta信号域，还具有一个胞内的共刺激域，因此表达第二代CAR的T细胞显著改善了其体内增殖能力、扩增能力和活化的持久性。为了进一步优化CAR T细胞的抗肿瘤功效，第三代CAR除了CD3 zeta外，还引入了两个胞内顺式作用的共刺激结构域。此后，通过修饰胞内结构域以进行诱导表达或组成型表达细胞因子，第四代CAR从第二代CAR开发获得。第五代和最新一代CAR也是从第二代CAR衍生而来，整合了细胞因子受体的胞内结构域。

我们的CAR表达慢病毒载体可用于生产慢病毒并高效地向T细胞转导CAR表达盒。CAR表达慢病毒载体首先在大肠杆菌中进行克隆，其中CAR表达盒包含scFV结构域、铰链区、跨膜区和胞内CD3 zeta信号源、共刺激域，并位于慢病毒载体的两个长末端重复序列（Long terminal repeats，LTR）之间。慢病毒载体构建完成后与辅助质粒一起转染进入包装细胞。在包装细胞中，位于两个LTR之间的DNA片段会被转录成RNA，由辅助质粒表达的病毒蛋白将其包装形成病毒颗粒。包装后的活体病毒将会被释放到上清液中，可以直接收集或进一步浓缩病毒转染靶细胞。

当病毒转导靶细胞时，释放到宿主细胞中的病毒RNA借助逆转录酶逆转录成双链DNA，然后随机整合进宿主细胞的基因组中。在病毒载体中，位于两个LTR的DNA片段和病毒基因组都会稳定整合到靶细胞的基因组中。

通过改造优化，我们的慢病毒载体删除了与病毒包装和转导相关的基因（这些基因由辅助质粒进行表达，用于病毒包装过程），使产生的慢病毒颗粒是复制缺陷型的。即包装的病毒只具有转导靶细胞的能力，而无法在靶细胞中进行大量复制，因而具有很高的生物安全性。

关于该载体系统的更多信息，请参考以下文献。

我们的CAR表达慢病毒载体适用于第三代慢病毒系统，可进行第二代CAR表达。经优化，该载体在大肠杆菌体内具有很高的拷贝数，包装的活病毒具有很高的滴度，对大多数宿主细胞具有高效的转导能力，能有效地把载体整合到靶细胞基因组并实现外源基因的高水平表达。

图1 通过使用表达CAR的Jurkat细胞和表达CD19的靶细胞（Ramos细胞）检测表面CD69分子的上调，验证活化的CAR诱导的T细胞。（A）携带靶向CD19的CAR基因的慢病毒转导Jurkat细胞，与表达CD19的Ramos细胞共同培养。与CD19结合的Jurkat细胞被激活，表现出CD69表面抗原上调表达。（B）孵育后流式细胞术分析CAR jurkat细胞的激活程度。与CD19+Ramos细胞（蓝色）共同培养后的CAR jurkat细胞显著增加了CD69的表达量，表明Jurkat细胞在CAR介导下被激活。

CAR表达盒的稳定整合：常规质粒转染只能实现CAR的瞬时表达，这种质粒会随着宿主细胞的分裂而不断丢失，在快速分裂的细胞中显得尤为显著。相反，慢病毒转导能稳定地将CAR表达盒整合到细胞的染色体中，使其可以长期表达CAR。

滴度高：我们的病毒载体可以包装出高滴度的病毒。我们提供的病毒包装服务，病毒滴度可以达到>10⁹ TU/ml。在这样的病毒滴度下，如果选择合适的剂量去转导体外培养的哺乳动物细胞，则转导效率可接近100%。

高转导效率：慢病毒对T细胞表现出良好的转导效率。在开发基于慢病毒的CAR T细胞时，为达到临床注射的细胞数量要求，来自患者的少数T细胞需要被方便地转导和扩增。

自定义启动子：我们的慢病毒载体已经过优化，其5' LTR的启动子已进行了自失活。用户可以自定义启动子驱动CAR表达。这相对于只能依赖自身5' LTR启动子驱动CAR表达的MMLV载体来说是一个巨大的优势。

基因拷贝数相对均一：通常情况下，采用病毒转导的方式可以比较均一的将外源基因转入靶细胞中，而传统的质粒转染则呈现出较高的不均一性，导致某些细胞会获得较多拷贝质粒而某些则会获得较少甚至完全没有。

体内外实验均有效：我们的载体不仅拥有良好的体外细胞转导能力，同样适用于体内活体动物实验。

安全性：我们的病毒载体系统具备了以下两大特点，因而具有非常高的安全性。一、病毒包装和转导所必需的基因由三个辅助质粒分开表达。二、5' LTR的启动子自失活。因此，在进行病毒包装和病毒转导的时候不会产生具有复制能力的病毒颗粒，使用我们的载体对人体的健康威胁也是最低的。

载体容量受限：野生型的慢病毒基因组大小约为9.2 kb，而在我们的慢病毒载体中，病毒包装和转导的必要元件约为2.8 kb，余下6.4 kb的空间容纳客户的目的序列。当病毒载体超过以上大小限制，病毒的包装滴度可能会降低。我们的CAR表达慢病毒载体除了CAR序列外，还包含有其他功能性元件如启动子、抗药基因等，因此会超过6.4 kb的默认容量限制，导致滴度受到一定影响。

插入突变风险：由于CAR表达慢病毒载体序列可以插入细胞基因组，因此存在一定的插入突变风险。然而对比逆转录病毒，这种风险会相对低。逆转录病毒的生成的DNA序列有插入基因转录起始位点附近和原癌基因的倾向。

技术复杂：使用慢病毒载体时，需要在包装细胞中产生活病毒，然后测定病毒滴度。因此慢病毒转染相对于常规质粒转染，技术难度更高，周期更长。

高生产成本：生成GMP级别的慢病毒比质粒载体要显然更高，现已是其中一个限制基于慢病毒的CAR T细胞的临床应用发展的主要因素。

CMV promoter: Human cytomegalovirus immediate early promoter. It drives transcription of viral RNA in packaging cells. This RNA is then packaged into live virus.

5' LTR-ΔU3: A deleted version of the HIV-1 5' long terminal repeat. In wildtype lentivirus, 5' LTR and 3' LTR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome and point in the same direction. Upon viral integration, the 3' LTR sequence is copied onto the 5' LTR. The LTRs carry both promoter and polyadenylation function, such that in wildtype virus, the 5' LTR acts as a promoter to drive the transcription of the viral genome, while the 3' LTR acts as a polyadenylation signal to terminate the upstream transcript. On our vector, 5' LTR-ΔU3 is deleted for a region that is required for the LTR's promoter activity normally facilitated by the viral transcription factor Tat. This does not affect the production of viral RNA during packaging because the promoter function is supplemented by the CMV promoter engineered upstream of Δ5' LTR.

Ψ: HIV-1 packaging signal required for the packaging of viral RNA into virus.

RRE: HIV-1 Rev response element. It allows the nuclear export of viral RNA by the viral Rev protein during viral packaging.

cPPT: HIV-1 central polypurine tract. It creates a "DNA flap" that increases nuclear importation of the viral genome during target cell infection. This improves vector integration into the host genome, resulting in higher transduction efficiency.

Promoter: The promoter driving your downstream CAR expression cassette is placed here. 

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest because it is believed to facilitate translation initiation in eukaryotes.

CD8-leader: Leader signal peptide of T cell surface glycoprotein CD8 alpha chain. Directs transport and localization of the protein to the T cell surface. 

scFv: Single chain variable fragment derived from a monoclonal antibody of known specificity. Recognizes cells in an antigen-specific manner. 

Hinge: Extracellular hinge region of the CAR. Connects scFv with the transmembrane region providing stability and flexibility for efficient CAR expression and function; enhances efficiency of tumor recognition; improves expansion of CAR T cells. 

Transmembrane domain: Transmembrane domain of the CAR. Anchors the CAR to the plasma membrane and bridges the extracellular hinge as well as antigen recognition domains with the intracellular signaling region; enhances receptor expression and stability. 

Costimulatory domain: Intracellular costimulatory domain of the CAR. Improves overall survival, proliferation, and persistence of activated CAR T cells. 

CD3zeta: Intracellular domain of the T cell receptor-CD3ζ chain. Acts as a stimulatory molecule for activating T cell-mediated immune response. 

WPRE: Woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element. It enhances viral RNA stability in packaging cells, leading to higher titer of packaged virus.

mPGK promoter: Mouse phosphoglycerate kinase 1 gene promoter. It drives the ubiquitous expression the downstream marker gene.

Marker: A drug selection gene (such as neomycin resistance), a visually detectable gene (such as EGFP), or a dual-reporter gene (such as EGFP/Neo). This allows cells transduced with the vector to be selected and/or visualized.

3' LTR-ΔU3: A truncated version of the HIV-1 3' long terminal repeat that deletes the U3 region. This leads to the self-inactivation of the promoter activity of the 5' LTR upon viral vector integration into the host genome (due to the fact that 3' LTR is copied onto 5' LTR during viral integration). The polyadenylation signal contained in 3' LTR-ΔU3 serves to terminates all upstream transcripts produced both during viral packaging and after viral integration into the host genome.

SV40 early pA: Simian virus 40 early polyadenylation signal. It further facilitates transcriptional termination after the 3' LTR during viral RNA transcription during packaging. This elevates the level of functional viral RNA in packaging cells, thus improving viral titer.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.