Baculovirus-AAV嵌合病毒载体

概述

腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）无论在体内和体外试验中均被广泛应用于基因转导实验。AAV可以感染大量种类的哺乳动物细胞，在人体内只产生极低的免疫原性，这些特点使重组AAV成为当今应用于基因治疗的高效病毒载体。在基因治疗的临床前和临床阶段的研究中，可通过Baculovirus-AAV嵌合病毒载体高效且大规模生产重组AAV以符合剂量和安全性要求。

利用杆状病毒（Baculovirus）生产重组AAV需要将两种杆状病毒共转导昆虫Sf9细胞。第一种杆状病毒表达位于两个AAV ITR元件之间的目的基因，第二个杆状病毒表达AAV rep和cap基因。为制备两种杆状病毒，每种杆状病毒的表达框均被克隆至一个杆状病毒转移质粒。该质粒的整个表达框与庆大霉素（Gentamycin）抗性基因位于质粒上的两个Tn7转座子末端序列之间（Tn7L和Tn7R）。该质粒被转化至带有杆粒（Bacmid）和辅助载体的大肠杆菌。杆粒可以被看作一个特别巨大的质粒，包含了修饰过后的杆状病毒基因组序列。该序列上带有lacZ基因以及位于该基因内部的attTn7位点。因此转移质粒上两个Tn7之间的序列通过Tn7转座酶与杆粒重组后将插入lacZ基因，随后通过庆大霉素抗性筛选和蓝白筛选即可获得重组成功的大肠杆菌。从大肠杆菌提取的杆粒纯化后用于转染昆虫Sf9细胞。

我们的baculovirus-AAV嵌合病毒载体表达的定制目的基因位于两个AAV ITR元件之间。利用该载体生产的重组杆状病毒与表达AAV rep和cap基因的辅助杆状病毒可共转导至昆虫细胞，然后利用昆虫细胞中大规模制备重组AAV。

使用AAV转导宿主细胞时，两个ITR之间的外源DNA及病毒基因组一同进入细胞，线性双链DNA基因组以游离体DNA的形式存在于细胞核中。在分裂细胞中，由于游离体DNA不跟随细胞复制，AAV基因组将随着细胞分裂逐渐丢失，因此在整体细胞中被稀释。重组AAV的DNA随机整合宿主基因组的现象是非常罕见的，这对于需要考虑外源DNA插入宿主基因组引发致癌风险的基因治疗来说是相当适用的特点。

AAV的另一个应用优点在于，在大多数情况下，可以在生物安全1级（BSL1）设施中完成操作。重组AAV是复制缺陷型的，不会引起炎症反应和引发人类疾病。

人们已从自然界中鉴定出许多AAV病毒株，根据病毒表面衣壳蛋白的不同抗原将它们分成不同的血清型。不同血清型的病毒具有不同的组织嗜性（即感染组织特异性）。当我们的AAV载体使用不同的衣壳蛋白包装病毒时，则会赋予病毒不同的血清型。目前我们使用Baculovirus-AAV嵌合病毒载体包装的AAV提供以下几种血清型：AAV1、2、6、8和9。AAV包装时的ITR序列来源于AAV2，这是一种常用的AAV载体构建方式，不影响血清型。另一方面，决定血清型的衣壳蛋白基因由Rep/Cap包装质粒编码。关于AAV的更多血清型信息，请参照下表。

以血清型分类以组织嗜性分类

血清型	组织嗜性
AAV1	Smooth muscle, CNS, brain, lung, retina, inner ear, pancreas, heart, liver
AAV2	Smooth muscle, CNS, brain, liver, pancreas, kidney, retina, inner ear, testes
AAV3	Smooth muscle, liver, lung
AAV4	CNS, retina, lung, kidney, heart
AAV5	Smooth muscle, CNS, brain, lung, retina, heart
AAV6	Smooth muscle, heart, lung, pancreas, adipose, liver
AAV6.2	Lung, liver, inner ear
AAV7	Smooth muscle, retina, CNS, brain, liver
AAV8	Smooth muscle, CNS, brain, retina, inner ear, liver, pancreas, heart, kidney, adipose
AAV9	Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, inner ear, testes, kidney, adipose
AAV-rh10	Smooth muscle, lung, liver, heart, pancreas, CNS, retina, kidney
AAV-DJ	Liver, heart, kidney, spleen
AAV-DJ/8	Liver, brain, spleen, kidney
AAV-PHP.eB	CNS
AAV-PHP.S	PNS
AAV2-retro	Spinal nerves
AAV2-QuadYF	Endothelial cell, retina
AAV2.7m8	Retina, inner ear

组织嗜性	推荐AAV血清型
Smooth muscle	AAV1, AAV2, AAV3, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10
CNS	AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-PHP.eB
PNS	AAV-PHP.S
Brain	AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8
Retina	AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV2-QuadYF, AAV2.7m8
Inner ear	AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8
Lung	AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAV-rh10
Liver	AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
Pancreas	AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9, AAV-rh10
Heart	AAV1,AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ
Kidney	AAV2, AAV4, AAV8, AAV9, AAV-rh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
Adipose	AAV6, AAV8, AAV9
Testes	AAV2, AAV9
Spleen	AAV-DJ, AAV-DJ/8
Spinal nerves	AAV2-retro
Endothelial cells	AAV2-QuadYF

关于该载体系统的更多信息，请参照以下文献。

References	Topic
Methods Mol Bio. 1937:91 (2019)	AAV production using baculovirus expression vector system
Mol Ther. 17:1888 (2009)	Using a simplified baculovirus-AAV expression vector system yields high-titer rAAV stocks
Mol Ther. 12:1217 (2005)	Production of pseudotyped rAAV vectors using a modified baculovirus expression system

亮点

Baculovirus-AAV嵌合病毒载体可以用于高效地并大规模生产重组AAV。我们的载体系统经过优化，可以在大肠杆菌中以高拷贝数形式复制，中间需要包装出高滴度的重组杆状病毒，最后制备的AAV具有很低的安全风险。

优势

高效与易放大：Sf9昆虫细胞可以在大型生物反应器中以高密度的悬浮细胞方式培养，因此用其生产AAV，对比传统利用哺乳动物细胞制备AAV的方法更高效、生产上更易放大规模。

安全性高：杆状病毒对于哺乳动物和植物是非致病性的，并且不能在昆虫细胞外复制。因此，使用昆虫细胞株的生产环境仅需要最低的生物安全等级。此外，昆虫细胞的培养使用的是无血清培养基，排除了任何动物源成分，进一步强化了该载体系统的生物安全性。使用该系统生产的重组AAV仍然是复制缺陷型的，不会引发任何人类疾病。

对宿主基因组造成破坏的低风险性：在转导进入靶细胞后，AAV基因组在细胞核保持着游离DNA的状态，可以降低宿主基因组被破坏而致癌的风险，使其成为人类体内实验的理想载体。

高病毒滴度：利用我们的baculovirus-AAV嵌合病毒载体可以包装成高滴度的AAV病毒。经Sf9昆虫细胞生产的AAV病毒其滴度可达到>10¹³ GC/ml。

宿主范围广：针对不同来源的常用哺乳动物（如人、小鼠和大鼠）细胞和组织，将我们的AAV载体包装成对其具有亲和性的血清型，可轻易实现高效转导。但是，某些类型的细胞仍然难以转导（见下文不足之处），这与所用的血清型有关。

体内外实验均有效：我们的载体不仅能用于体内活体动物实验，还具有体外细胞转导能力。

不足之处

载体容量小：AAV是我们所有病毒载体系统中装载量最小的。AAV的两个ITR之间所能容纳的最大序列长度是4.7 kb，允许使用者插入~4.2 kb的目的序列。

难以转导特定类型的细胞：当利用合适的血清型进行包装时，我们的AAV载体系统可以转导很多不同类型的细胞，包括非分裂细胞。不同AAV血清型对不同类型的细胞具有不同的嗜性，针对某种特定类型的细胞需要特定血清型。

技术复杂：通过baculovirus-AAV表达系统生成重组AAV需要多个步骤，包括克隆目的基因至杆状病毒转移载体、从转移载体制备重组杆粒、杆粒转染并使用杆状病毒转导昆虫细胞等，这些步骤相对于传统的三质粒转染法生产AAV具有更高的技术复杂性、花费时间也更长。通过订购我们的基于baculovirus-AAV嵌合病毒载体的AAV包装服务可以轻松解决这些问题。

载体关键元件

5' ITR: 5' inverted terminal repeat. In wild type virus, 5' ITR and 3' ITR are essentially identical in sequence. They reside on two ends of the viral genome pointing in opposite directions, where they serve as the origin of viral genome replication.

Promoter: The promoter that drives your gene of interest is placed here.

Kozak: Kozak consensus sequence. It is placed in front of the start codon of the ORF of interest to facilitate translation initiation in eukaryotes.

ORF: The open reading frame of your gene of interest is placed here.

BGH pA: Bovine growth hormone polyadenylation signal. It facilitates transcriptional termination of the upstream ORF.

3' ITR: 3' inverted terminal repeat. See description for 5’ ITR.

Tn7L: Tn7 transposon left terminal element. It is recognized by Tn7 transposase. DNA flanked by Tn7R and Tn7L can be transposed by Tn7 transposase into attTn7 docking sites.

Ampicillin: Ampicillin resistance gene. It allows the plasmid to be maintained by ampicillin selection in E. coli.

pUC ori: pUC origin of replication. Plasmids carrying this origin exist in high copy numbers in E. coli.

Tn7R: Tn7 transposon right terminal element. It is recognized by Tn7 transposase. DNA flanked by Tn7R and Tn7L can be transposed by Tn7 transposase into attTn7 docking sites.

Gentamicin: Gentamicin resistance gene. It allows for drug selection of E. coli carrying recombinant bacmids.