云舟生物提供全面的shRNA基因敲低解决方案，帮助您获得高效的RNAi效果。我们提供基于U6启动子驱动的shRNA的和自定义启动子驱动的miR30 shRNA的两种shRNA表达方式，根据您的实验需求可灵活控制shRNA的表达。我们可以对shRNA载体进行多种类型多种滴度的病毒包装（如慢病毒、AAV、腺病毒），以帮助您将shRNA递送至难以转染的细胞中。我们还可以专门为哺乳动物细胞中的大规模基因功能丧失筛选构建shRNA文库。此外，我们的线载体设计平台与shRNA 数据库涵盖了多种物种，让您轻松找到合适的shRNA打靶您的目的基因。
亮点
定制shRNA载体
使用我们高度直观的线上载体设计平台，你可以选择超过30种包括病毒类型与非病毒的shRNA载体骨架，并且可以自由组合启动子、报告基因、药筛标记等载体元件。我们的shRNA数据库可帮助您方便地选择打靶目的基因的shRNA，同时无需您自行设计序列。我们还同时提供shRNA打靶效率检测载体，以让您可以测试您的shRNA的干扰效率。 对于我们的shRNA载体，您均可购买额外的下游服务，如质粒DNA制备和病毒包装服务。
除去以上的列表中的载体系统，我们还可以提供Cre-lox条件表达shRNA载体。请发送设计咨询给我们。
常用shRNA载体
云舟生物提供一系列常用shRNA载体，可表达scramble shRNA或照载体上的常见基因的shRNA。在将这些载体加入购物车之后，您还可以购买质粒DNA提取和病毒包装等下游服务。 您可以使用下方的载体工具栏订购您的U6 shRNA载体。
如果您需要订购miR30 shRNA载体，请向我们发送设计咨询
shRNA病毒包装
我们提供多种规格的的优质的慢病毒、AAV 和腺病毒包装服务，可以将shRNA递送只难转染的细胞中。我们拥有专有的技术和试剂，大大改进了病毒包装的滴度、纯度、活性和一致性，还可以针对病毒包装时的所使用的病毒载体进行优化。
shRNA（3+1）套装
需要注意的是，并非所有经验设计的shRNA均会有良好的干扰效果。shRNA的干扰效果取决于多个因素，包括shRNA的长度、茎环结构、GC含量、shRNA的热力学稳定性、靶序列的二级结构、对于其它基因的脱靶效应等。一般来说，约50%~70·%的shRNA具有可见的干扰效果，而其中的20-30%具有强的干扰效果。因此，选择多个shRNA用于打靶有助于发现敲低效率最高的shRNA。
云舟生物提供的shRNA（3+1）套装包含3个针对你的目的基因的定制shRNA载体、3个对应的定制shRNA病毒，以及一个可用于测试多个shRNA的高性价比的scramble对照病毒。我们目前提供慢病毒、AAV以及腺病毒的shRNA（3+1）套装。
您可以使用下方的工具栏订购shRNA（3+1）套装。
请注意该工具栏只适用于设计U6 shRNA载体。如果您需要设计miR30-shRNA或IPTG诱导表达的shRNA载体，或者无法找到您的打靶基因，请发送设计咨询给我们。
如果您仅需要构建3个shRNA质粒载体，我们亦提供shRNA载体3件装套装，详情如下。
| 服务名称 | 价格（CNY） | 周期 | |
| shRNA慢病毒载体（3件装）构建 | ￥1,980 | 4-7天 | 订购咨询 |
| shRNA腺相关病毒载体（3件装）构建 | ￥1,980 | ||
| shRNA腺病毒载体（3件装）构建 | ￥3,880 | 6-12天 |
shRNA文库
shRNA文库在研究疾病通路、药物治疗中的细胞反应、发育过程、基因调控方面，是进行大规模基因功能丧失筛选的强大且高性价比的工具。根据您的需要，我们可以把构建的文库转化大肠杆菌，也可以以DNA或病毒的形式给您发货。我们定制的文库都会进行NGS测序验证以确定文库的质量。
我们提供高质量的针对人和小鼠基因的shRNA慢病毒文库产品。对于每个物种，我们提供了两种规格的慢病毒shRNA文库产品：全基因组大库（针对约19,000个RefSeq基因）和精华基因小库（针对PubMed Central上约2,000个最常被引用的基因），每个基因对应5-6个不同的shRNA。我们的shRNA文库已通过了NGS测序和功能验证。
预制shRNA文库的亮点
| 产品名称 | 基因数量（个） | shRNA数量（条） | 规格* | 货号 | 价格（CNY） | |
| 人类精华基因shRNA文库 | 2,161 | 12,471 | 标准规格 (>1.0x108 TU/ml, 1 ml) | LVM(Lib190505-1037bjk) | ￥13,980 | |
| 小鼠精华基因shRNA文库 | 2,233 | 12,472 | 标准规格 (>1.0x108 TU/ml, 1 ml) | LVM(Lib190505-1039sgb) | ￥13,980 | |
| 人类全基因组shRNA文库 | 18,432 | 92,917 | 标准规格 (>1.0x108 TU/ml, 1 ml) | LVM(Lib190505-1038ngq) | ￥13,980 | |
| 大规格 (>1.0x108 TU/ml, 5 ml) | LV5M(Lib190505-1038ngq) | ￥17,480 | ||||
| 小鼠全基因组shRNA文库 | 19,790 | 92,917 | 标准规格 (>1.0x108 TU/ml, 1 ml) | LVM(Lib190505-1042tfx) | ￥13,980 | |
| 大规格 (>1.0x108 TU/ml, 5 ml) | LV5M(Lib190505-1042tfx) | ￥17,480 | ||||
* 对于精华基因文库，标准规格包装的慢病毒可以满足>40次筛选的要求，且达到100x的覆盖率。对于全基因组文库，标准规格包装的慢病毒可以满足>5次筛选的要求，且达到100x的覆盖率；大规格包装的慢病毒可以满足>25次筛选的要求，且达到100x的覆盖率。
shRNA基因敲低细胞稳转株
云舟可为您提供长期敲低目的基因的需求定制构建shRNA敲低细胞稳转株。我们基于shRNA分值测试三个候选的shRNA，然后将最佳敲低效率的一个通过慢病毒转导生产细胞稳转株。我们通过RT-PCR验证细胞中的基因敲低水平。此外，我们还会进行一系列标准的QC检测，如无菌检测、支原体检测，然后才会放行最终的细胞产品。
| 细胞模型 | 构建方式 | 交付内容 | 价格 | 周期 |
|---|---|---|---|---|
| shRNA基因敲低稳转株构建 | 慢病毒转导 | 多克隆细胞群 | ￥18,980.00起 | 8-13周 |
| 单克隆细胞株 | ￥23,980.00起 | 13-18周 |
短发夹RNA（Short hairpin RNA，shRNA）是具有茎环结构的RNA分子，可用于通过互补碱基配对靶向mRNA序列并促使其降解，因此广泛用于各种RNAi应用。通常可以使用双链DNA载体以病毒和非病毒形式将shRNA引入靶细胞。当用shRNA载体转染或转导细胞时，shRNA在细胞核中转录形成发夹结构。shRNA发夹结构包含一个茎环，一条RNA反义链和与其互补的正义链。转录形成的shRNA离开细胞核，在细胞质中经过Dicer加工，然后加载到RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex，RISC）复合体上，随后目标mRNA被识别并降解（图1）。
图1 U6 shRNA和miR-shRNA介导的基因敲低
shRNA相对于siRNA可取得更显著的基因敲低效率，因此成为流行的RNAi方式。下表总结了两者的具体的特点：
| shRNA基因敲低 | siRNA基因敲低 | |
|---|---|---|
| 递送方法 | 根据载体类型进行转染或者转导 | 转染 |
| 敲低时长 | 长期 | 瞬时 |
| 游离体抑或稳定整合 | 根据不同的递送方式，可具有游离体或者稳定整合的形式 | 游离体 |
| 添加筛选标记 | 可添加荧光或者药物筛选标记 | 否 |
| 适用细胞类型 | 适用于相当广泛的细胞类型 | 只适合易转染细胞 |
| 脱靶效应 | 低 | 高 |
| 自身降解速度 | 低 | 高 |
控制shRNA表达
有两种常用方法来控制载体上的shRNA表达：基于U6启动子的shRNA 表达和基于miR的shRNA表达。虽然基于U6的shRNA载体使用 RNA聚合酶III启动子驱动简单茎环 shRNA 的表达，基于miR的shRNA 载体则使用RNA聚合酶II启动子表达适配microRNA支架的 shRNA。这两种shRNA在细胞质内通过相似的机制被加工，最后导致靶基因沉默。然而，在细胞核内转录后，基于miR的shRNA与基于U6的shRNA不同，由于其结构内存在miR内源序列，其加工方式更像初级miRNA（图1）。
miR shRNA载体中的RNA聚合酶II启动子包含了组织特异性、可诱导的或可变强度等启动子等类型，从而使其可应用于组成型U6启动子无法应用的各种实验场景。相对于其它的基因敲低载体系统，RNA聚合酶II启动子在基于miRNA的shRNA系统中可有效转录长转录本，因此该系统具有几个额外优势。比如说，可以多个shRNAmiR可以转录为单个多顺反子，且在细胞内可加工形成成熟的shRNA。这允许使用单个转录本敲低多个基因或靶向同一基因的多个区域。因此，该载体可用于表达单个或多个shRNAmiR。其次，在该载体系统中，用户选择的蛋白质编码基因可以放在shRNAmiRs的多顺反子中。此ORF的表达可用于直接监测shRNA转录（如果使用标记基因ORF）或用于需要ORF和shRNA共表达的其他情景。
虽然miR shRNA载体在控制shRNA表达上更为灵活，我们发现U6 shRNA载体相对miR shRNA载体的敲低效果的鲁棒性更佳。因此除非必须使用miR shRNA载体，通过我们会推荐首先使用U6 shRNA载体用于RNAi实验。
下表比较了U6 shRNA载体与miR shRNA载体的特点：
| U6 shRNA载体 | miR shRNA载体 | |
|---|---|---|
| shRNA结构 | 简单的茎环shRNA | shRNA 适配一个microRNA 骨架 |
| shRNA长度 | 50-70 nt | >250 nt |
| 启动子 | RNA聚合酶III启动子，如 U6和H1 | RNA聚合酶II启动子，如广泛性启动子和组织特异性启动子 |
| shRNA加工机制 | 只在细胞质中经过Dicer加工 | 在细胞核内经过Drosha加工，在细胞质中通过Dicer加工 |
| 一个载体上可表达的shRNA数量 | 通常为单shRNA | 单个或多个shRNA |
| 是否可以在shRNA转录本上表达其它ORF | 否 | 是 |
| 基因敲低效率 | 鲁棒性较高 | 鲁棒性较低 |
| 毒性 | 高细胞毒性 | 较低的细胞毒性 |
试验验证
我们的U6 shRNA慢病毒载体经过基因敲低效率验证，结果如下图所示。结果展现了U6 shRNA与miR30 shRNA之间的敲低效率比较。
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图2 U6 shRNA慢病毒载体与miR30 shRNA慢病毒载体对EGFP的敲低效率比较。(A)U6启动子驱动的shRNA表达的慢病毒载体与miR30 shRNA（4条shRNA）慢病毒载体分别包装成慢病毒，然后转导稳定表达EGFP的HEK293T细胞。药筛前后流式细胞术检测EGFP表达情况。（B）药筛前，EGFP表达在U6 shRNA的作用下减少了46%（P<0.001）,在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA（单shRNA）作用下减少了13%（P<0.001），在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA（4条shRNA）作用下减少了44%（P<0.001）。（C）EGFP表达在U6 shRNA的作用下减少了72%（P<0.001）,在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA（单shRNA）作用下减少了60%（P<0.001），在CMV启动子驱动表达的miR30 shRNA（4条shRNA）作用下减少了67%（P<0.001）。EGFP的相对表达量通过转导与未转导细胞的荧光强度中值（Median fluorescence intensities，MFI）的比值计算。三次重复实验，图中显示SD值，p值根据Tukey检验计算。
shRNA数据库
云舟生物的在线shRNA载体设计工具专门为多个物种的shRNA设计进行了优化，可帮助您针对靶基因设计出高干扰效率的shRNA序列。我们设计和评估shRNA的规则与RNAi consortium（TRC）使用的规则类似。所有的干扰分值均≥0，平均数约为5，标准差约为5，95%的分值均≤15。若一个shRNA的干扰分值是15，则表示具有很高干扰效率且易于克隆；若干扰分值为0，则表示干扰效果较差或难以克隆。
当您在我们的在线平台上设计shRNA载体时，您可以选择在我们的数据库中搜索您的目的基因。输入您的基因名称后，您将在我们的数据库中看到针对您的目的基因的所有shRNA的详细信息，包括指向UCSC数据库的链接，从而可查看其基因组序列和所有转录本。我们的数据库按照针对目的基因的shRNA的干扰分值对shRNA进行排序，并推举出三个干扰分值最高的shRNA。请注意干扰分值只是一个参考值。实际的干扰效果可能会与预测的分值有偏差，低分值的shRNA也可能产生较好的干扰效果。同时，靶向转录本的 3’ UTR也可以起到干扰作用。 我们的网站包含丰富的学习资料，可帮助您安排并实施您的RNAi实验。
参考文献
Mol Cell. 9:1327 (2002);Characterization of miR30-based gene knockdown.
Nucleic Acids Res. 34:e53 (2006); Development of miR155-based shRNA vectors.
J Gene Med. 9:620 (2007); Development of IPTG-inducible gene knockdown system.
Proc Natl Acad Sci USA. 101:10380 (2004);Development of Cre-lox-regulated gene knockdown system.
暂无
无论是shRNA介导的基因敲低抑或是gRNA介导的基因敲除（如CRISPR或TALEN）都可能是研究基因功能丧失的富有价值的实验方法。为了确定哪种方法最适合您的实验应用，以下是您应该考虑的一些事项。
基因敲低载体
基因敲低载体表达shRNA抑制靶基因的mRNA，通过引发mRNA的切割抑制翻译过程。shRNA敲低不改变靶基因的DNA序列。
基因敲除载体
CRISPR和TALEN都是通过指导核酸酶切割基因组中的特定靶位点来发挥作用。然后这些切割位点被细胞低效地修复，从而导致修复部位的永久性突变，比如产生基因的小片段插入或碱基缺失。这类突变的一部分会导致基因的阅读框移码、出现提前终止密码子等，最终导致目的基因的功能丧失。如果同时靶向基因组中两个相邻紧密的切割位点（距离几个kb），也可以导致其间区域的删除。
shRNA敲低永远不会完全抑制靶基因的表达。即使对于最有效的shRNA，靶基因的一些残留表达也会保留。相比之下，在一小部分经过处理的细胞群中，CRISPR和TALEN可以产生永久性突变，这可能导致基因功能完全丧失。
shRNA载体通常在转染/转导的细胞时获得较好的均一性，实验之间的一致性也较佳。相比之下，由于引入突变是随机的，CRISPR和TALEN的基因编辑效果在细胞之间的差异相当大。为了完全敲除细胞中的目的基因，必须敲除细胞中基因的所有拷贝。鉴于正常细胞具有任何基因的两个拷贝（X或Y连锁基因除外），而癌细胞可以具有两个以上的拷贝，这种完全敲除的细胞可能只占所有处理后的细胞的一小部分。出于这个原因，核酸酶介导的敲除实验需要通过测序来筛选克隆，以确定所有目的基因拷贝都被敲除的子细胞群。
已有报道表明shRNA介导的基因敲低和核酸酶介导的基因敲除均会产生脱靶效应。脱靶效应的表征可以通过使用多个不同的shRNA 靶向同一基因来评估。如果一个基因被在多个不同的shRNA作用下仍然表现出一致的表征，则这种表征通常则不是脱靶效应带来的。对于CRISPR或TALEN基因敲除，应分析含有功能丧失突变的多个克隆，以包含可能由脱靶突变引起的任何表征。此外，可以对克隆进行脱靶位点测序，通过生物信息学方法鉴定以查看它们是否已发生突变。
并不是所有的shRNA都会起作用
根据我们的经验和来自客户的反馈，使用3-4个shRNA进行干扰测试时，通常只有2-3个有比较合理的干扰效果。所以，在使用shRNA时，重要的是要认识到并非所有的shRNA都能正常工作。通常情况下，约50-70％的shRNA具有干扰效果，其中只有约20-30％的shRNA具有比较明显的效果。如果您使用几个shRNA靶向同一个基因都没有一个能产生满意的干扰效果，最好的解决方式是尝试更多的shRNA，特别是那些经过文献验证的shRNA。目前，许多研究人员使用靶向相同基因的shRNA库（即不同shRNA的混合物）进行实验，以期提高干扰效率。
干扰效率检测方法不当
最常用评估shRNA干扰效率的灵敏测定方法是RT-qPCR，您可能需要尝试几对引物，筛选出最具特异性和效率的引物对。通常情况下，RT-qPCR引物应跨越内含子，即设计在两个外显子上，以免扩增基因组DNA。当使用新引物时，建议您先进行预扩增实验，并将PCR产物进行电泳检测目的条带，或者甚至可以通过测序验证PCR产物是否正确。在进行RT-qPCR的同时，应注意设置minus-RT对照以评估基因组DNA的污染水平。您可以使用NCBI引物设计工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）来检查引物质量。 干扰效率也可以通过蛋白质印迹法（Western blot）进行评估。然而，该方法常产生来自非特异性抗体结合的假阳性条带，从而导致误判没有干扰效果。因此，在使用时需要确保抗体的特异性。 您使用的shRNA可能只打靶基因的某个转录本 在设计shRNA时，我们推荐您使用那些能靶向单个基因多个转录本的shRNA，除非您只想打靶特定转录本。VectorBuilder提供针对常见物种的shRNA数据库。当您将shRNA元件插入载体时，您可以选择shRNA数据库，通过搜索目的基因查看所有可用的shRNA详细信息。您还可以打开其中的UCSC链接，查看shRNA序列在基因组和转录本中位置等信息。
您使用的shRNA可能只打靶基因的某个转录本
在设计shRNA时，我们推荐您使用那些能靶向单个基因多个转录本的shRNA，除非您只想打靶特定转录本。VectorBuilder提供针对常见物种的shRNA数据库。当您将shRNA元件插入载体时，您可以选择shRNA数据库，通过搜索目的基因查看所有可用的shRNA详细信息。您还可以打开其中的UCSC链接，查看shRNA序列在基因组和转录本中位置等信息。
我们设计和评估shRNA的规则与RNAi consortium（TRC）使用的规则类似。对于每个RefSeq转录本，我们会搜索出所有的21 mers作为候选靶位点。以下因素会降低干扰效率/特异性或影响克隆，含有这些特点的序列将会被排除。主要因素包括：含有≥4个连续相同碱基，含有≥7个G或C，GC含量<25％或> 60％以及序列的5'端含有AA碱基。如果靶点内部含有茎环结构，或是3'末端的GC含量较高，或是该靶点是已知的miRNA核心序列或是会打靶到其他基因，则该靶点的分值就会较低。若靶位点存在于一个基因的多个转录本，则该靶点的分值就会较高。 所有的干扰分值均≥0，平均数约为5，标准差约为5，95%的分值均≤15。若一个shRNA的干扰分值是15，则表示具有很高干扰效率且易于克隆；若干扰分值为0，则表示干扰效果较差或难以克隆。
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