云舟生物提供全方位的适用于体外和体内实验的CRISPR基因编辑解决方案。我们的 CRISPR 产品涵盖多种预制或定制CRISPR载体（质粒、病毒和RNA）。我们的CRISPR系统可使用主流多种工具病毒（慢病毒、AAV和腺病毒）进行包装以实现在难转染细胞中的高效基因递送，此外我们也专注于构建用于基因敲除、基因激活、基因抑制以及CRISPR筛选的高质量CRISPR文库。经过我们独特设计的全基因组双gRNA敲除文库是用于人类和小鼠基因功能筛选的强大工具。
亮点
定制CRISPR载体
CRISPR介导的基因编辑需要靶细胞共表达Cas9和特异性gRNA。使用我们高度直观的线上载体设计平台，您可以选择超过30种载体骨架（非病毒的、病毒的或转座子类型的载体）以及并可通过随意组合载体元件（启动子、Cas9变体、荧光标记和药物筛选标记）来定制表达Cas9的gRNA。此外，我们还提供多合一和双载体系统，可用常规质粒、慢病毒、AAV、腺病毒和PiggyBac载体表达Cas9和gRNA。 我们全面的CRISPR载体系列还包括以DNA模板形式存在的基因打靶供体载体，以满足精确指示序列变化的基因编辑需求，比如通过HDR在目标位点进行点突变和大片段敲入。此外，我们还提供CRISPRa和CRISPRi载体，分别用于实现靶基因的转录激活或抑制。我们提供的CRISPR基因表达调控载体包括基于dCas9-SAM或dCas9-SunTag机制的CRISPR激活和基于dCas9-KRAB或dCas9-KRAB-MeCP2机制的CRISPR抑制等应用类型。
将CRISPR载体添加到您的购物车时，您还可以在其下游服务购买质粒DNA制备、RNA制备和病毒包装。
注意：AAV基因组的装载量为4.7kb。来自Streptococcus pyogenes的常用SpCas9基因长度为4.2kb，当其与启动子、polyA信号序列以及gRNA表达盒等其他组件组合时，整个序列几乎无法装入AAV病毒。因此，我们的标准AAV CRISPR系统使用来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的较短的SaCas9（3.2kb）。请注意，SaCas9识别的PAM序列是NNGRR或NNGRRT（首选），而SpCas9的PAM序列是NGG。我们还可以根据要求构建AAV SpCas9载体。
预制CRISPR载体
除了定制的CRISPR/Cas9载体，我们还提供预制的Cas9表达载体、gRNA载体以及适用于CRISPRa和CRISPRi的辅助载体。我们的载体默认以甘油菌形式发货。您也可以在载体设计的下游服务进一步订购质粒DNA制备、RNA制备以及病毒包装等服务。
| 载体系统 | 载体名称 | Vector ID |
|---|---|---|
| hCas9表达载体（质粒载体） | pRP[Exp]- mCherry/Hygro-CBh>hCas9 | VB010000-9378bvk |
| hCas9表达载体（慢病毒） | pLV[Exp]- CBh>hCas9/Hygro | VB010000-9509hde |
| SaCas9表达载体（AAV） | pAAV[Exp]-CMV>SaCas9 | VB010000-9382per |
| hCas9表达载体（腺病毒） | pAV[Exp]-CBh>hCas9 | VB010000-9381pwj |
| hCas9表达载体（piggyBac） | pPB[Exp]-mCherry/Hygro-CBh>hCas9 | VB010000-9379gqq |
| Scramble gRNA对照载体（质粒载体） | pRP[gRNA]-EGFP/Puro-U6>Scramble_gRNA | VB010000-9358ttk |
| Scramble gRNA对照载体（慢病毒） | pLV[gRNA]-EGFP/Puro-U6>Scramble_gRNA | VB010000-9528hyf |
| Scramble SagRNA对照载体（AAV） | pAAV[SagRNA]-EGFP-U6>Scramble_SagRNA1 | VB010000-9361zjr |
| Scramble gRNA对照载体（腺病毒） | pAV[gRNA]-EGFP-U6>Scramble_gRNA1 | VB010000-9360nph |
| Scramble gRNA对照载体（piggyBac） | pPB[gRNA]-EGFP/Puro-U6>Scramble_gRNA1 | VB010000-9362zuk |
| hCas9与scramble gRNA共表达载体（质粒载体） | pRP[CRISPR]-EGFP/Puro-hCas9-U6>Scramble_gRNA1 | VB010000-9354ztt |
| hCas9与scramble gRNA共表达载体（慢病毒） | pLV[CRISPR]-hCas9/Puro-U6>Scramble_gRNA1 | VB010000-9527dpk |
| SaCas9与scramble SagRNA 共表达载体（AAV） | pAAV[CRISPR]-SaCas9-U6>Scramble_SagRNA | VB010000-9357zmm |
| hCas9与scramble gRNA共表达载体（腺病毒） | pAV[CRISPR]-hCas9/EGFP-U6>Scramble_gRNA1 | VB010000-9356pna |
| dCas9-SAM激活系统的MS2/P65/HSF1表达载体（慢病毒） | pLV[Exp]-EF1A>MS2/P65/HSF1/Hygro | VB010000-9513dyx |
| dCas9-SAM激活系统的dCas9/VP64表达载体（慢病毒） | pLV[Exp]-EF1A>dCas9/VP64/Bsd | VB010000-9512pbs |
| dCas9-SAM scramble msgRNA对照载体（慢病毒） | pLV[msgRNA]-EGFP/Puro-U6>Scramble_gRNA | VB010000-9551kgr |
| dCas9-KRAB-MeCP2表达载体（慢病毒） | pLV[Exp]-CBh>dCas9/ KRAB/MeCP2/Hygro | VB010000-9515bvx |
CRISPR病毒包装
慢病毒、AAV 和腺病毒被广泛用于将CRISPR组分递送至哺乳动物细胞中。云舟生物提供优质的慢病毒、AAV 和腺病毒包装服务，帮助您在难转染细胞中实现高效的CRISPR基因编辑。我们的病毒包装使用我们专有的技术和自我研发的试剂，大大改进了产毒的滴度、纯度、活性和一致性。我们的包装方案还会针对我们的载体构建服务中使用的病毒载体系统进行优化。
CRISPR（3+1）套装
如果您需要同时订购多个CRISPR慢病毒，我们推荐您订购我们的CRISPR（3+1）套装。如果您仅需要订购3个用于CRISPR实验的gRNA慢病毒载体，我们亦提供CRISPR载体构建3件装：
| 服务名称 | 价格（CNY） | 周期 | |
| CRISPR慢病毒载体（3件装）构建 | ￥1,980 | 4-7天 | 订购咨询 |
| CRISPRi慢病毒载体（3件装）构建 | ￥1,980 |
gRNA和Cas9 mRNA
云舟生物可提供用于转染和微量注射的Cas9 mRNA和gRNA，这些Cas9 mRNA和gRNA专门为靶向用户选择的目标位点而设计，并且有助于 RNA 组分成功递送至哺乳动物细胞中。我们的Cas9 mRNA可用于表达野生型 hCas9或 Cas9 切口酶（Cas9(D10A)）。我们的gRNA设计和评分使用了CRISPR文库设计（CLD）中的规则，并应用一组经验规则来设计针对用户选择的基因/位点的最佳gRNA。
| 名称 | 规格 | 价格（CNY） | 周期 | |
|---|---|---|---|---|
| hCas9 mRNA | >500 ng/ul，25 ul，无酶水，无菌 | ￥2,980.00 | 2-4天 | 订购咨询 |
| Cas9(D10A) mRNA | ||||
| 定制的gRNA* | ￥2,580.00 |
用于精确基因编辑的供体DNA
云舟生物提供线性化质粒形式的ssODN或dsDNA的供体DNA模板，用于指导基于HDR机制的DNA修复，从而在CRISPR切割位点精确地进行DNA序列编辑，这通常包括点突变以及小片段或大片段敲入。ssODN可用于在目标位点插入短的DNA序列（<60bp），比如小标签或限制性酶切位点，而dsDNA供体则可用于靶向敲入较大的序列（长达4-5kb），例如荧光标签和其他报告基因。
| 名称 | 价格 | 周期 | |
|---|---|---|---|
| ssODN（通常为120-200 nt） | ￥2399.00起 | 2-3周 | 订购咨询 |
CRISPR文库
云舟生物专门为常用的CRISPR应用定制并构建各种文库，包括用于基因功能筛选的敲除文库、用于基因获得性功能筛选或非编码区域调节功能筛选的CRISPRa文库，以及用于基因功能丧失筛选或非编码区域调节功能筛选的CRISPRi文库。此外，我们还可以构建用于单细胞筛选的CRISPR barcode文库，以及利用其它CRISPR技术构建的文库
我们可以根据您的需求，将您的文库以甘油菌、质粒DNA或病毒形式提供。我们的定制文库均经过NGS测序验证。
除了定制的CRISPR文库外，我们还提供预制的双gRNA慢病毒文库，用于人类和小鼠的全基因组基因敲除筛选。对于基因敲除筛选，双gRNA文库比单gRNA文库更强大，因为通过一对针对同一基因的gRNA引入大片段缺失所在产生功能丧失突变比使用单个gRNA具有更高的效率。人和小鼠双gRNA文库以预制的高滴度慢病毒的形式制成，分别靶向20,048个人的和20,493个小鼠基因。每个基因都被不同载体上的4-6对不同的gRNA冗余地靶向。
CRISPR系统解决方案
CRISPR系统的多功能性使其适用于哺乳动物细胞中的各类基因编辑应用。我们的技术团队在分子生物学应用方面拥有丰富的经验，可以为您的所有CRISPR基因编辑项目提供完整的技术方案。我们可以帮助您处理下面列出的常见CRISPR应用，或与您合作开发任何新的CRISPR应用。立即向我们发送设计请求，以获得免费的服务方案。
CRISPR基因编辑原理
常规使用的CRISPR系统由两个组分构成：Cas9蛋白和向导RNA（Guide RNA，gRNA）。最常用的Cas9是从Streptococcus pyogenes细菌中通过基因工程获得的（又名SpCas9或hCas9）。它是一种 RNA 引导的 DNA 核酸酶，可以在靶位点产生DNA双链断裂 (Double strands DNA break，DSB)（图1）。另一种广泛使用的Cas9变体，即具有“切口酶”性质的Cas9，比如Cas9(D10A)，可对DNA单链进行切割。如果将Cas9切口酶与两个gRNA同时使用，并且两个gRNA分别靶向位于单个目标区域两侧的两条相反DNA链，则切口酶将在每条链上产生一个单链切口，从而导致目标区域发生DSB。一旦通过CRISPR系统产生DSB，细胞就会激活非同源末端连接 (Non-homologous End Joining-NHEJ，NHEJ) 途径来修复DNA断裂，这通常会导致少量碱基的随机缺失，或者发生更罕见的碱基插入和碱基替换等突变。当这些突变破坏了蛋白质编码区的序列时（例如发生移码突变），则可能引发功能性的基因敲除。
图1 CRISPR引发的DNA修复机制
另一种情况是，当共同引入外源的供体DNA模板和CRISPR组件时，细胞可以通过同源重组修复 (Homology directed repair，HDR) 途径修复DSB。这种修复方式效率较低，并导致目标基因组DNA序列被供体序列替换，该机制有利于精确地改变DNA序列，例如产生点突变或在目标位点敲入供体DNA序列。供体DNA模板可以是单链寡核苷酸（ssODN）或dsDNA 片段（通常是线性化的质粒DNA）。ssODN适用于引入点突变或小标签插入，而dsDNA片段则更适用于大片段敲入。
图2 RNP法验证基因敲除效率。通过gRNA-Cas9核糖核蛋白（RNP）方法获得纯合敲除突变。（A）编辑过的RNP复合物通过电转法导入靶细胞，分离单克隆细胞并筛选。使用PCR和Sanger测序验证细胞的基因型。（B）本案例在小鼠结肠癌细胞中进行基因编辑。RNP通过电转进入细胞后，可以结合靶基因的两个位点以敲除一段长13 kbp的区域。P1-P4四条引物用于三个PCR反应以区分敲除和野生型克隆。（C）PCR结果验证了克隆1中的纯合敲除突变，并进一步在（D）靶基因测序结果中得到印证。
催化活性失活的Cas9（dCas9）可以与不同形式的转录复合物结合以实现CRISPR介导的内源性基因转录调控。对于转录激活，通常可使用协同激活介导系统（Synergistic Activation Mediator，SAM）。该系统使用了三种组件：dCas9/VP64融合蛋白、MS2/P65/HSF1辅助蛋白、以及一个修饰的gRNA。dCas9蛋白经过改造结合了VP64，一种协同转录激活因子，而经过修饰的gRNA则含有一个MS2适配体，可以招募MS2复合物。MS2复合物包含转录激活结构域NF-kB (p65)和HSF1。VP64包含四个来源于单纯疱疹病毒蛋白16的重复序列，其C端融合至Cas9蛋白使其可以招募转录激活相关的蛋白来激活基因表达。p65和HSF1的转录激活结构域还可以作为潜在的转录激活因子招募与启动子或增强子结合的辅因子。总而言之，dCas9/VP64和MS2/P65/HSF1复合物可以协同工作的方式以激活靶基因表达，如图3所示。除了SAM系统，云舟生物还可以提供dCas9-VP64-p65-Rta（VPR）转录激活结构域，使用EB病毒R顺式激活因子替换HSF1转录激活结构域。
相对的，如果需要抑制靶基因表达，dCas9也可以被改造为含有一个转录抑制结构域，如KRAB（krüppel-associated box）结构域和MeCP2。我们可提供两种dCas9/KRAB辅助载体：原版的以及改造优化后的两个版本。该改造版本将dCas9同时融合了两个转录抑制结构域KRAB/MeCP2，以便提供针对靶位点效果更强的转录抑制。当gRNA招募dCas9/KRAB/MeCP2到内源性启动子，如图3所示，转录被抑制。KRAB结构域常在人的转录因子中被找到，是人类基因组中所发现的最常见的强效转录抑制因子之一。MeCP2可以通过招募组蛋白脱乙酰基酶，造成染色质凝聚和表观遗传抑制，进一步增强KRAB介导的转录抑制效果。CRISPR基因调控可以被用于大量的应用场景，比如测试染色质上的调控元件、调控目的基因的表达、以及全基因组筛选等。
图3 基于慢病毒的CRISPRa系统的基因上调表达效果。（A）SAM复合物示意图。首先向NIH3T3细胞共转导两种分别携带dCas9:VP64和MS2:P65:HSF1的慢病毒，进行抗性筛选。然后使用递送msgRNA的第三种慢病毒转导细胞，并用另一种抗生素进行筛选。（B）针对靶向mBrn2基因启动子区域而设计的msgRNA。（C） 通过qRT-PCR测量mBrn2的相对基因表达，量化了使用Scramble、msgRNA以及空白对照（NC）转导的并经过抗性筛选的NIH3T3细胞中mBrn2转录产物表达量。Mean±SD，*P<0.05，Turkey事后检验。
图4 基于慢病毒的CRISPRi基因抑制表达效果。（A）转录阻遏复合物示意图。首先向Jurkat细胞转导携带dCas9:KRAB:MeCP2的慢病毒以表达转录阻遏复合物，然后进行抗性筛选。然后用另一种慢病毒转导细胞以表达scramble或者gRNA，并进行额外的抗性筛选。（B） 靶向CXCR4基因启动子区的gRNA。（C） 通过qRT-PCR测量CXCR4的相对基因表达，量化了使用Scramble、gRNA以及空白对照（NC）转导的病经过抗性筛选的Jurkat细胞中CXCR4转录产物表达量。Mean±SD，***P<0.001，****P<0.0001，Tukey事后检验。（D） 通过western blot证实了含有打靶gRNA的Jurkat细胞中的CXCR4表达水平下调。（E）向细胞表面表达有CXCR4蛋白的Jurkat细胞转导scramble以及打靶CXCR4的gRNA，使用流式细胞术验证。CXCR4使用单克隆一抗（Ab）标记，并连接带有荧光基团的二抗。阴性对照中的Jurkat细胞只使用了无标记的二抗。（F）转导了打靶CXCR4的gRNA的Jurkat细胞相较于转导了scramble gRNA的平均减少了50%细胞表面的CXCR4含量。Mean±SD。
CRISPR基因递送方法
CRISPR组件可以通过不同的方式引入哺乳动物细胞内（图5）：
图5 递送CRISPR组分至细胞内的方法
下表展示的是每种递送方式的优势与不足，有助于为您选择合适的CRISPR递送系统提供参考：
| 递送方法 | 优势 | 不足 |
|---|---|---|
| gRNA与Cas9质粒 |
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| gRNA与Cas9病毒 |
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| 混合的gRNA和Cas9 mRNA |
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| 有功能的gRNA-Cas9 RNP复合物 |
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gRNA数据库
云舟生物的线上CRISPR载体设计工具可提供针对人类、小鼠以及大鼠全基因组的gRNA数据库，旨在帮助您快速设计具有高打靶效率的CRISPR载体。我们的gRNA设计和评分使用了CRISPR文库设计（CLD）中的规则，即对于一个打靶某个物种中的N(20)NGG序列的给定的gRNA，我们搜索该物种基因组中的所有潜在脱靶位点，且与目标序列比对≤3个错配碱基。以这种方式识别的每个潜在脱靶位点，都会计算一个脱靶分值。 然后将所有脱靶位点的分值汇总用于计算gRNA的最终特异性分值，该数值介于0到100之间，值越高表示靶向特异性越强。请注意，特异性分值只是一个粗略的指导。实际的打靶效率和特异性可能与预测值不同。得分低的gRNA可能仍然有效。
当您在我们的线上平台上设计CRISPR载体时，您可以在我们的数据库中搜索您的目标基因。 输入基因名称后，您将在我们的数据库中看到针对您的目标基因的所有可用的gRNA的详细信息。 我们的全基因组 gRNA 数据库可让您轻松地为您的目标基因挑选合适的向导序列，同时无需自行查找和分析打靶位点，对比常见的gRNA设计工具有着无可比拟的优势。
此外我们的在线“学习中心”包含丰富的学习资源，可帮助您安排并实施您的CRISPR实验。
暂无
为了确定哪种方法最适合您的实验应用，以下是您应该考虑的一些事项。
基因敲低载体
基因敲低载体表达shRNA抑制靶基因的mRNA，通过引发mRNA的切割抑制翻译过程。shRNA敲低不改变靶基因的DNA序列。
基因敲除载体
CRISPR和TALEN都是通过指导核酸酶切割基因组中的特定靶位点来发挥作用。然后这些切割位点被细胞低效地修复，从而导致修复部位的永久性突变，比如产生基因的小片段插入或碱基缺失。这类突变的一部分会导致基因的阅读框移码、出现提前终止密码子等，最终导致目的基因的功能丧失。如果同时靶向基因组中两个相邻紧密的切割位点（距离几个kb），也可以导致其间区域的删除。
shRNA敲低永远不会完全抑制靶基因的表达。即使对于最有效的shRNA，靶基因的一些残留表达也会保留。相比之下，在一小部分经过处理的细胞群中，CRISPR和TALEN可以产生永久性突变，这可能导致基因功能完全丧失。
shRNA载体通常在转染/转导的细胞时获得较好的均一性，实验之间的一致性也较佳。相比之下，由于引入突变是随机的，CRISPR和TALEN的基因编辑效果在细胞之间的差异相当大。为了完全敲除细胞中的目的基因，必须敲除细胞中基因的所有拷贝。鉴于正常细胞具有任何基因的两个拷贝（X或Y连锁基因除外），而癌细胞可以具有两个以上的拷贝，这种完全敲除的细胞可能只占所有处理后的细胞的一小部分。出于这个原因，核酸酶介导的敲除实验需要通过测序来筛选克隆，以确定所有目的基因拷贝都被敲除的子细胞群。
已有报道表明shRNA介导的基因敲低和核酸酶介导的基因敲除均会产生脱靶效应。脱靶效应的表征可以通过使用多个不同的shRNA 靶向同一基因来评估。如果一个基因被在多个不同的shRNA作用下仍然表现出一致的表征，则这种表征通常则不是脱靶效应带来的。对于CRISPR或TALEN基因敲除，应分析含有功能丧失突变的多个克隆，以包含可能由脱靶突变引起的任何表征。此外，可以对克隆进行脱靶位点测序，通过生物信息学方法鉴定以查看它们是否已发生突变。
CRISPR系统和TALEN系统均能用于在体外细胞和模式生物这种进行基因编辑。以下是这两种系统的特性对比：
CRISPR
CRISPR系统使用位点特异的向导RNA (gRNA) 将Cas9核酸酶引导至其基因组中的目标位点以产生DNA切割。靶序列的长度通常约为20 bp。若靶序列中包含一些错配位点仍可能被识别和切割。
TALEN
TALEN系统使用的是一对嵌合蛋白，每个嵌合蛋白包含一个融合到Fokl核酸酶结构域的且作为TAL效应子的DNA结合结构域（识别特定DNA序列）。这对蛋白被设计成与基因组中的一对靶位点结合，每个靶位点长约18 bp，且二者相隔一个14-20 bp的间隔区。在与 DNA 结合后，这对蛋白上的Fokl核酸酶结构域发生二聚化，然后导致两个靶位点之间的间隔区内的序列发生切割。
CRISPR和TALEN系统均在基因编辑上均表现出良好的效率，这也具体取决于应用的物种和细胞类型。一般来说，CRISPR系统的组分进入细胞后引发的DNA切割比TALEM系统更高效。
CRISPR系统的gRNA靶向约20 bp的DNA序列，而TALEN系统需要约36 bp的靶序列。此外，Cas9/gRNA 复合物对靶序列中碱基错配（最多5 bp错配）的容忍度高于 TALEN。因此，TALEN介导的DNA切割比CRISPR具有更好的特异性，也不太可能在基因组中发生脱靶性的切割。相比之下，已有报道表明CRISPR系统在体外细胞系中可产生脱靶效应，而对CRISPR敲除小鼠的分析则表明体内实验时脱靶频率较低。最新的CRISPR系统的显着增强了CRISPR的特异性。通过使用双gRNA和Cas9切口酶（仅包含一个具有催化活性的核酸酶结构域的Cas9突变体，如Cas9(D10A)和Cas9_H840A），在靶向区域附近产生两个单链DNA切口，从而导致DSB发生在可修复的靶向区域内。在这种设计中由于双gRNA可将靶向序列的长度扩展至约40 bp，因此最大限度地减少了脱靶效应。
TALEN系统可以针对基因组中的几乎任何位置进行设计。相比之下，CRISPR系统中的靶位点选择受限于PAM序列（通常为NGG）的要求，该序列位于gRNA靶向的DNA序列的3'末端。CRISPR系统的这种特性这并不会阻碍基因敲除，因为对靶基因中的任何地方切割都是有效的基因编辑，但可能难以对基因的特定位置进行切割或实现位点的特异性突变。为了通过将CRISPR系统应用于可精确编辑特定基因组位点，可以将包含所需编辑序列的同源重组供体载体或长寡核苷酸与靶位点的上游和下游同源臂一同递送至细胞中，以指导靶位点发生HDR介导的DNA修复。
在基因编辑实验中，使用CRISPR系统在几个方面表现出对比TALEN具有更低的技术难道。 首先，对于载体构建，CRISPR 系统只需要合成一个短的gRNA，因为Cas9/gRNA 复合物的靶向依赖于机制简单的RNA/DNA杂交，而TALEN 系统需要根据每个独特的蛋白-DNA相互作用重新设计TAL的DNA结合域。与TALEN系统相比，gRNA显然是更便宜、更容易设计和构建的，而且TALEN系统打靶每个位点总是需要两个载体。其次，对于一些应用，例如注射小鼠胚胎，Cas9蛋白和gRNA可以通过直接注射来高效地递送，但TALEN系统不能。最后，CRISPR系统在基因筛选实验中的应用非常广泛，表达数千种不同gRNA的CRISPR筛选文库可以很容易地以高通量方式构建。
对于CRISPR介导的基因编辑，Cas9核酸酶通过特异性的gRNA作用至靶位点以产生DNA切割。在大多数情况下，为了实现简单的基因敲除，可以将单个gRNA与Cas9共同使用以产生DSB，然后通过NHEJ进行低效率的DNA修复，从而导致序列发生永久性突变，比如产生基因的小片段插入或碱基缺失。这类突变的一部分会导致基因的阅读框移码、出现提前终止密码子等，最终导致目的基因的功能丧失。
双gRNA则一般用于结合Cas9(D10A)切口酶对靶位点的两条反向DNA链进行切割。在这种方法中，切口酶将在两条链上产生单链切割，每一条链上的切割位点通过两条gRNA中的一条引导，然后在靶位点产生DSB。一般来说，这种方法减少潜在的脱靶效应，因为该种DSB的产生要求两条gRNA同时靶向序列。
当使用Cas9(D10A)切口酶和外源供体 DNA 模板将特定的碱基（例如敲入）引入感兴趣的基因时，也可以使用双gRNA。在这种方法中，两条反向的DNA链将被两个gRNA靶向位于所需突变位点两侧的两个位点，然后通过HDR途径利用外源DNA供体模板来修复切除的序列。
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