LNP封装

冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）结果显示我们封装的LNP-mRNA结构完整且大小均一。

图1 冷冻透射电子显微镜（cryo-TEM）视野下的LNP-mRNA。LNP保存于-80℃含有蔗糖的Tris溶液（pH7.4），冰上解冻后拍摄。比例尺=100 nm。 

动态光散射（DLS）分析表明我们的LNP-mRNA可以达到很低的PDI值（PDI<0.1）。云舟生物承诺我们的LNP-mRNA的Zeta电势范围在-10 mV至+10 mV之间。 

图2 LNP粒径和Zeta电势分析多分散指数（PDI）。（A）和Zeta电势（B）通过动态光散射（DLS）测定。该方法可以测量粒子运动带来的散射光强度的波动变化。反映的则是样本中的粒子尺寸的异质性。样本中的Zeta电势范围在-1.872到+1.872 mV之间。

图3 使用LNP高效递送mRNA。对比使用传统转染试剂，LNP封装的EGFP mRNA表现出更高递送效率。向Jurkat和293T细胞转染1 ug的EGFP mRNA： （A）流式细胞术分析EGFP表达水平。（B）转染后24 h拍摄细胞荧光图片。实验中使用的EGFP mRNA均无核苷修饰。 荧光强度中值表示为MFI。

图4 鼠转导萤光素酶mRNA（Luc mRNA），检测mRNA表达情况和免疫反应。（A）注射后6 h、24h、和48 h通过活体成像检测萤光素酶活性。 （B）为量化外源RNA在小鼠中引发的炎症反应，注射后48小时检测小鼠血清中两种促炎细胞因子IL-6和TNF-α的浓度。 误差线表示标准偏差。小鼠种系：C57BL/6J；小鼠年龄：8周；注射方法：肌肉注射。（C）向Balb/C小鼠注射30 ug的LNP封装的mRNA，注射后14天，分离Balb/C小鼠的脾脏细胞，针对病毒抗原A、病毒抗原B以及PBS对照进行IFN-γ ELISpot试验。

图5 EGFP mRNA转染一级T细胞。（A）转染后24小时，流式细胞术测定表达EGFP的细胞数。无处理对照（NC）、商业转染试剂封装的mRNA、以及LNP封装的mRNA均分别转染了一级T细胞。（B）通过流式细胞术测量的EGFP阳性细胞的百分比（灰色）和经过量化的对应的中位荧光强度（黑色）。

图6 表达萤火虫荧光素酶（FLuc）的LNP-mRNA在偶联anti-CD31抗体后在肺部的表达效率提升。小鼠品系：C57BC/6J ；小鼠年龄：6-8周；小鼠性别：雌性；注射途径：尾静脉注射；对照：IgG2a偶联的Fluc-mRNA。

图7 LNP配方优化可提高质粒体外转染效率。（A）表达EGFP的质粒（pDNA-CMV>EGFP）分别采用SM102和ALC-0315两种LNP封装，转染HEK293T细胞。转染后24 h拍摄EGFP荧光图像。（B）基于SM102优化的配方可以获得相较于商业化PEI转染试剂高约6.6倍的转染效率。该实验中的质粒（pDNA-CMV>Fluc）表达萤火虫荧光素酶报告基因。

图8 采用云舟生物新型LNP配方封装萤火虫荧光素酶报告基因表达质粒（pDNA-CAG>Luc+），按照0.6 mg每千克体重静脉注射小鼠。注射后96 h观察萤火虫荧光素酶报告基因表达情况。