治疗性IVT RNA开发

图1 优化的UTR改善mRNA表达效率。高斯荧光素酶mRNA使用不同的UTR组合表现出不同的表达水平。在12孔板中接种293T细胞，细胞密度2.3×10⁵ 细胞/孔。每孔转染1 ug mRNA。转染后6 h、24 h、48 h、72 h以及96 h，取20 ul细胞测定高斯荧光素酶活性。

图2 对编码序列进行密码子优化提高了mRNA的体外和体内表达水平。（A）HEK293T细胞中表达HiExpress^TM萤火虫荧光素酶IVT mRNA以及其它版本的荧光素酶mRNA。细胞生长于12孔板，每孔转染0.5 ug mRNA。转染后6 h、24 h、48 h以及72 h测定荧光素酶活性。（B）向C57BL/6成年小鼠肌肉注射30 ug LNP包封的荧光素酶mRNA，注射后6 h、24 h、48 h测定荧光素酶活性。Fluc WT表示野生型荧光素酶mRNA。Fluc WT (co)表示经过密码子优化的荧光素酶mRNA。Fluc2表示luc2荧光素酶mRNA。HiExpress^TM Fluc表示云舟生物HiExpressTM萤火虫荧光素酶IVT mRNA。

图3 polyA长度分析。使用核糖核酸酶将polyA尾巴从mRNA上切割下来，然后进行oligo dT亲和色谱纯化，LS-MS分析核苷酸信息。（A）基于尿素PAGE的polyA大小分析。变性尿素PAGE电泳mRNA酶切后的60 ng 120 nt和150 nt的polyA尾巴。（B）基于LC-MS 的polyA大小分析。120 nt长度的120 p mol polyA分子量的逆卷积质谱结果。（C）期望为120 nt的polyA尾巴长度观测分布。柱状图表明polyA长度的同一性较好。误差线表示3次酶切试验结果的标准偏差。polyA加权平均长度为123 nt。

图4 不同polyA尾巴长度、但是Cap1和UTR相同的IVT EGFP mRNA转染HEK293T细胞。

图 5. 完整性良好的长序列IVT mRNA。使用变性凝胶电泳鉴定云舟生物不同批次的IVT mRNA。在不同体外转录条件下均能获得长度 >10,000 nt的序列完整的IVT mRNA。 

图6 基于LC-MS的加帽效率分析。（A）共转录法和（B）酶加法均能实现很高的加帽效率。

图7 修饰的核苷酸增强mRNA表达，同时减少dsRNA产生。（A）293T细胞中表达萤火虫荧光素酶IVT mRNA。使用的mRNA包括无修饰的、N1-甲基假尿苷（N1-methylpseudouridine，m1Ψ）修饰的、5-甲基胞苷（5-methylcytidine，m5C）修饰的，以及m1Ψ/m5C修饰的。细胞生长于12孔板，每孔转染1 ug mRNA。293T细胞转染萤光素酶mRNA后6 h、24 h、48 h的萤光素酶活性。误差线表示标准偏差。平均荧光强度使用带颜色的柱状图表示。(B) 等量修饰的和无修饰的EGFP IVT mRNA（每斑点750 ng）经过磁柱纯化，使用斑点杂交估测dsRNA杂质含量。

残留dsRNA是IVT产物中主要引起免疫反应的杂质。 斑点杂交试验结果表明额外的纯化步骤毒药去除残留dsRNA至关重要。

图8 不同纯化方式的dsRNA去除效率。不同的纯化方式纯化等量的hSpCas9 IVT mRNA（每斑点1500 ng），然后使用斑点杂交估测残留dsRNA。缩写：HIC，Hydrophobic interaction chromatography；IP-RP，Ion-pair reversed-phase liquid chromatography。