在制药产业，mRNA治疗方法作为新型治疗方案，在新冠疫苗研发以及肿瘤免疫治疗方面具备非常大的发展潜力和应用前景。近期，全球首款呼吸道合胞病毒（RSV）mRNA疫苗获批上市，首个LNP-mRNA体内基因编辑疗法公布积极长期数据等消息更是振奋了mRNA这条赛道。

众所周知，质控方法和质量标准的研究是决定产品能否进入临床研究以及顺利上市的重要环节之一。美国药典（USP）标准历来被认为是一种重要的公共医药工具，2023年4月，USP重磅更新了新的一版《mRNA疫苗质量分析方法-指南草案》（后文简称“2023版草案”），2023版草案从整个mRNA疫苗产品的全生命周期出发，基于质量源于设计（QbD）的理念，涵盖了包括DS和DP在内的表征和放行测试。

mRNA是一种单链RNA分子，可以形成二级结构（如发夹和R-环）和三级结构，并可能与其他mRNA分子发生相互作用从而形成聚集。而聚集体的存在可能会影响mRNA的稳定性与活性。因此，在2023版草案中收录了SEC-HPLC方法用于mRNA聚集体的定量测定方法。

近日，艾杰尔-飞诺美上海应用实验室采用全新推出的Biozen dSEC-7色谱柱对全长约为4.5K nt的Cas9 IVT mRNA及其聚集体进行分离并定量。通过体积排阻色谱法（SEC）可以让研究人员更好地理解和控制mRNA聚集体的形成，从而优化mRNA的生产工艺，提高产品质量。

为了尽可能保证mRNA构型的稳定，此应用选择了30℃的柱温。并且在0.3 mL/min的流速下对比了多种流动相的表现。其中最有代表性的三种分别是2023版草案中收录的SEC-HPLC推荐流动相150 mM磷酸钠缓冲液，更高离子强度的流动相150 mM磷酸钠缓冲液+100 mM氯化钠，以及另一种对于核酸类样品常用的SEC流动相体系50 mM Tris-Hcl缓冲液+250 mM氯化铵。

下图展示了三种类型流动相的结果：

图1 三种不同流动相下的峰形对比（绿色：150 mM磷酸钠缓冲液+100 mM氯化钠；红色150 mM磷酸钠缓冲液；蓝色：50 mM Tris-Hcl缓冲液+250 mM 氯化铵）

表1 不同流动相积分结果比较

通过上述实验证明飞诺美最新上市的700 Å孔径SEC柱能够很好的对大小约5K nt 的IVT mRNA样品进行聚集体分离。事实证明，孔径并非越大越好，优化的孔径分布更有利于聚集体分离。Biozen dSEC-7采用BioTi™生物惰性硬件，进一步降低了和生物大分子之间的次级相互作用，提高了产品的稳定性，极少量的样品即可获得足够的聚集体响应。实验结果表明，该色谱柱适合mRNA聚集体的质量研究和放行检测。

另外，SEC方法作为一种Native的分析方法，可以模拟出mRNA分子在不同的formulation中的原始状态，辅助用于formulation的筛选工作。

作为基因递送领域的领军企业，云舟生物致力于为全球客户提供高质量、高效率的基因递送产品及服务。继上次合作提供EGFP IVT mRNA样品后，在此次研究中，云舟生物再次提供了关键样品——Cas9 IVT mRNA，为研究提供了重要支持。CAS9作为新一代基因编辑技术，在疾病研究和治疗中具有巨大的发展前景。此次项目也将进一步作为双方合作的标杆示范项目，为双方未来开展更多行业领先方法和工艺研究，包括AAV、mRNA和基因药物载体平台方案带来更多合作空间。