• CRISPRi（CRISPR interference）慢病毒套装包含2种病毒：gRNA慢病毒和dCas9-Silencer2慢病毒。1个gRNA慢病毒同时携带gRNA表达盒子和Puromycin抗性基因。1个dCas9-Silencer2慢病毒同时携带dCas9-Silencer2表达盒子和Hygromycin抗性基因。病毒感染细胞后，病毒基因组整合到细胞基因组中，随细胞分裂而复制，实现外源基因长期稳定表达。gRNA和dCas9-Silencer2融合蛋白需同时存在，CRISPRi才能工作。使用Puromycin和Hygromycin两种抗生素筛选出成功感染2种病毒的细胞进行下游实验。
• dCas9（dead Cas9）是Cas9的突变体，缺失了核酸内切酶的能力。一旦表达，dCas9蛋白和gRNA将形成一个核糖核蛋白复合物（Ribonucleoprotein complex）。dCas9-gRNA复合体将任意地结合细胞基因组上的PAM序列（SpCas9的PAM序列为5'-NGG-3'），但只有gRNA分子的5‘引导序列（Guide sequence，约20 bp）与细胞基因组DNA配对时，dCas9才会充分解开靶序列的上下链，gRNA进一步与靶序列的其中一条链完全互补结合，此时，dCas9-gRNA复合体稳定地结合到靶序列上。CRISPRi系统中，一般将gRNA设计为靶向一个基因的TSS（transcription start site）位置（-50到+300区域为佳）。在此位置，dCas9-gRNA复合体本身就能物理性地阻碍RNA聚合酶的作用，从而影响基因的表达。dCas9-Silencer2是一个dCas9融合了KRAB等转录抑制子的融合蛋白。KRAB等转录抑制子能进一步抑制基因的表达。Silencer2版本的转录抑制子，在KRAB的基础上进行了优化，抑制效率更高。
• 多条gRNA作用一个基因的TSS区域，抑制效果更佳。

RNAi存在2类脱靶：序列相关性和非序列相关性

序列相关性脱靶：
仅凭有限的部分碱基互补，siRNA就能引起非目标mRNA的沉默。
取决于siRNA序列，⼀个siRNA可能抑制成百上千条转录本。

非序列相关性脱靶：
shRNA采⽤内源miRNA通路实现基因敲除。当⼤量shRNA导⼊细胞后，它们使RNAi系统达到饱和，并与内源miRNA竞争蛋白，例如Dicer、RISC和其它因子。由此，那些内源miRNA介导的基因调控受到干扰，导致不可以预期的脱靶。