体外转录的mRNA（IVT mRNA）在基因递送药物开发上具有多种优势，比如不引发插入突变、可采用无细胞制造方法以及使用个性化疗法。IVT mRNA可应用于多种疗法开发，包括疫苗、蛋白质替代疗法、CAR-T和CRISPR基因编辑。云舟生物的RNA科学家团队专注于IVT mRNA的设计、生产与LNP封装，并且可接受广泛类型的定制服务。
从载体克隆到LNP封装快至5周
可高度定制化，包括加帽方法、核苷修饰、poly(A)尾巴以及UTR区域
高度专业的团队为你的mRNA进行设计与优化，以取得最佳的表达量、产量和质量
下图展示mRNA的基本组成部分，每个组成部分在调节基因表达中都起着关键作用。这些组分可以使用多种方法可以在体外组装，而云舟生物能帮助您的项目评估实现最佳表达量、产量和纯度的方法。
图1 mRNA的结构与功能。
图2 小鼠转导萤光素酶 mRNA（Luc mRNA），检测 mRNA 表达情况和免疫反应。（A）注射后 6 h、24 h、和 48 h 通过活体成像检测萤光素酶活性。（B）为量化外源 RNA 在小鼠中引发的炎症反应，注射后 48 小时检测小鼠血清中两种促炎细胞因子 IL-6 和 TNF-α 的浓度。误差线表示标准偏差。小鼠种系：C57BL/6J；小鼠年龄：8 周；注射方法：肌肉注射。（C）向 Balb/C 小鼠注射 30 ug 的 LNP 包封的 mRNA，注射后 14 天，分离 Balb/C 小鼠的脾脏细胞，针对病毒抗原 A、病毒抗原 B 以及 PBS 对照进行 IFN-γ ELISpot 试验。
图3 hSpCa9 IVT mRNA在体外的基因编辑效果。（A）向表达EGFP的HEK293T细胞转染打靶RGFP的gRNA以及经过N1-甲基假尿苷（m1Ψ）修饰的hSpCas9 IVT mRNA。（B）通过显微镜（100X）观察无转染的（NC）以及转染的两组细胞。（C）流式细胞术定量检测荧光强度。（D）转染后48或72 h，转染后的细胞相对NC减少了约40%的EGFP表达量。（E和F）基因编辑效果通过T7E1酶切（E）和Sanger测序确认（F）。高亮表示的腺嘌呤表明了在靶序列的插入突变。
图4 IVT嵌合抗原受体（CAR）mRNA在293T细胞中的表达验证。（A）使用m1Ψ修饰的与无修饰的CD19 CAR mRNA转染293T细胞，这些mRNA均具有完整性良好的5’/3’ UTR以及poly(A)。（B）转染后24 h，将细胞与PE标记的人源CD19共孵育，FACS检测CAR表达。（C）使用anti-CD3zeta 抗体和WB进一步检测CAR表达。
图5 荧光标记的加帽EGFP IVT mRNA的制备和效果验证。（A）分别对常规加帽、Cy3标记加帽、Cy5标记加帽的EGFP IVT mRNA进行凝胶电泳。（B）将带有荧光基团帽子的两种EGFP IVT mRNA与常规加帽的EGFP IVT mRNA分别等量转染HEK293T细胞，转染后24小时，荧光显微镜观察对比荧光效果。（C）流式细胞术分别测定荧光标记的加帽EGFP IVT mRNA与常规加帽的EGFP IVT mRNA转染细胞后多个时间点的平均荧光强度，以及（D）转染后特定时间点的EGFP阳性细胞的占比%。（E）Cy3标记的加帽EGFP IVT mRNA转染细胞，在转染后多个时间点使用流式细胞术测定Cy3的平均荧光强度（柱子）以及Cy3阳性细胞占比%（圆点）。（F）Cy5标记的加帽EGFP IVT mRNA转染细胞，在转染后的多个时间点使用流式细胞术测定Cy5的平均荧光强度（柱子）以及Cy5阳性细胞占比%（圆点）。
| mRNA | circRNA | saRNA | |
| 结构 | 线性分子，通常包含5’ 帽子、5’ UTR、GOI的ORF、3’ UTR、以及poly(A)尾巴 | 环状分子，通常包含IRES元件和GOI的ORF | 线性分子，通常包含5’ 帽子、5’ UTR、复制酶和GOI的ORF、3’ UTR、以及poly(A)尾巴 |
| 帽子 | 需要5’ 帽子维持RNA稳定性并招募核糖体 | 没有帽子结构，采用IRES元件招募核糖体 | 需要5’ 帽子维持RNA稳定性并招募核糖体 |
| RNA长度（nt） | 100 ~ 10,000 | 1,000 ～ 5,000 | 7,000 ~ 10,000 |
| 稳定性 | 相对低 | 高 | 相对低 |
| 是否可以在生产时引入修饰核苷？ | 是 | 通常不添加修饰 | 是 |
| 表达水平 | 相对低 | 中 | 高 |
| 表达时长 | 相对短 | 中 | 长 |
Cap 0是指将N7甲基鸟苷（m7G）以5'至5'三磷酸连接的方式添加到真核mRNA的5’端。这种修饰是通过一系列共转录酶促反应添加的，其功能是调节细胞核输出、转录稳定性，并通过真核翻译起始因子（eIF4E）的识别促进mRNA的翻译。Cap 1是指除了m7G Cap之外，进一步在转录mRNA序列的第一个核苷酸（m7GpppNm）的2' O上添加甲基。在哺乳动物细胞中，Cap 1结构是mRNA被识别为自身而非先天免疫靶向的重要标志。在合成的mRNA中添加Cap 1结构可以增强体内mRNA的表达并降低其免疫原性。
体外转录mRNA的5'帽子可以以加入Cap类似物共转录的方式添加，也可以通过酶促反应在转录后添加。我们提供了两种加帽方式，其效率已通过LC-MS验证表现良好。根据客户首选的加帽方法，我们将从一开始就选择一个兼容的载体骨架来克隆IVT mRNA载体。
细胞包含位于胞质的和内涵体的两类RNA受体，它们在识别外源RNA时将激活免疫反应。修饰核苷酸通常存在于细胞的内源性RNA中。在IVT mRNA中加入某些修饰的核苷酸可降低其免疫原性，改变二级结构，并以序列依赖的方式提高翻译效率和延长半衰期。我们提供了多种类型的修饰核苷酸，包括常用的N1-甲基假尿苷（m1Ψ）和5-甲基胞苷（m5C）。N1-甲基假尿苷和5-甲基胞苷是最早发现的天然来源是 tRNA，然而，它们在 mRNA 中的功能直到最近才得到重视。尿苷和胞苷的这些甲基化衍生物可以在mRNA IVT和翻译中取代它们使用的默认核苷，而不改变传统的Watson-Crick碱基配对。在mRNA治疗中使用它们的一个主要优势是它们能够帮助RNA规避免疫受体的识别，从而减轻不必要的免疫反应，增强转录稳定性和翻译效率。
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