采用CRISPR IVT RNA进行基因编辑正迅速成为一种流行的基因编辑方法，其优点包括转基因表达不依赖细胞类型启动子、无基因组整合风险、且瞬时表达可以减少脱靶效应等。此外，由于Cas9 mRNA和gRNA可以一同被封装在脂质纳米颗粒中，有利于实现体外和体内高效的基因递送和基因编辑。云舟生物可提供一系列与CRISPR基因编辑相关的IVT RNA产品，包括Cas9 mRNA、Cas9-ABE mRNA和gRNA。如果您需要开展CRISPR实验，可点击此处与我们的RNA设计团队联系。
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Cas9 mRNA和gRNA共同封装LNP，实现快速高效的基因编辑。
Cas9序列经过优化，表达效率高，可供授权。
CRISPR IVT RNA可应用于包括体外和体内基因编辑以及CRISPR介导的碱基编辑等多种体系。以下数据验证了CRISPR IVT RNA在多种实验中的有效性。
图1 hSpCa9 IVT mRNA在体外的基因编辑效果。（A）向HEK293T-EGFP细胞转染IVT Cas9 mRNA以及打靶EGFP的两种gRNA。显微镜观察无转染的（NC）以及转染的两组细胞（B）并使用流式细胞术定量检测荧光强度（C和D）。（E和F）基因编辑效果通过T7E1酶切和Sanger测序确认。
图2 使用hSpCas9 mRNA进行双gRNA基因敲除的效果验证。（A）编码Cas9的载体经过线性化并经过体外转录，产生Cas9 mRNA。该Cas9 mRNA与一对靶向同个基因的gRNA共转染NIH/3T3细胞。（B）双gRNA打靶目的基因2-4号外显子的实验设计细节。用于PCR验证编辑效果的P1和P2引物经过设计可以扩增靶位点附近的序列。（C）凝胶电泳验证PCR扩增的基因组DNA确认基因编辑发生。
图3 CRISPR IVT RNA的体内基因敲除效果。（A）CRISPR IVT RNA的体内基因敲除的实验时间线。使用3.0 ug/g LNP封装的Cas9 mRNA/gRNA混合物、PBS分别静脉注射小鼠。注射后第7天分离肝脏，提取基因组DNA进行PCR扩增，T7E1酶切法验证基因编辑效果。（B）T7E1酶切产物的凝胶电泳结果确认基因编辑发生（星号位置的条带）。每条泳道代表一个生物学重复。
图4 腺嘌呤碱基编辑器（ABE） mRNA的体外实验效果验证。编码（A）ABE8.20-m和（B） ABE7.10 的mRNA分别与同一个gRNA共转染HEK293T细胞。转染后48 h提取细胞基因组DNA，PCR扩增靶位点区域，然后进行NGS分析。从碱基A到G的变化（星号）可在编辑窗口（虚线框）中检测到。第五个核苷酸分别取得了97.7%（A）和95.6%（B）的最高编辑效率。
云舟生物开发的HiExpressTM hSpCas9 IVT mRNA 经过序列优化，与其它人源化Cas9突变体相比具有更高的表达量，因此在细胞中达到相近的编辑效率所需的mRNA量更少，非常适合用于涉及疗法开发和生物技术应用的基因编辑实验。如需了解关于此产品授权情况的更多信息，请联系我们。
图5 云舟生物开发的HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA具有很高的表达和编辑效率。使用1 ug hSpCas9 IVT mRNA和经过密码子优化的HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA分别转染HEK293T细胞。转染后24 h，对以上两组实验组与非处理对照（NC）进行（A）Western blot分析，并对（B）Cas9相对表达水平进行标准化定量。（C）使用1,000 ng gRNA与指示剂量的hSpCas9 IVT mRNA、HiExpress™ hSpCas9 IVT mRNA分别共转染HEK293T细胞。转染后24 h，T7E1酶切法检测基因编辑效率。蓝色星号所指为完整的PCR扩增子，粉色箭头指所指为T7E1酶切产生的片段。
CRISPR-Cas9可以通过多种方法递送，包括质粒、重组病毒、gRNA-Cas9 RNP复合物，以及gRNA和Cas9 IVT mRNA的混合物，而这些方法都有各自的优势和局限性。研究人员应选择适合自己实验应用的递送方法，旨在通过最小化脱靶效应和不良效果获得最佳的编辑效率，而IVT RNA正迅速成为其中一种效果良好的基因编辑工具。
质粒的大量制备一般成本较低，并且可以通过技术相对简单的化学转染和电穿孔进行递送。然而，由于这些递送方式的自身特性，使得质粒载体主要限于体外应用。此外，质粒转染的效率在不同细胞类型之间差异很大，且转基因表达依赖于特定细胞类型的启动子活性，而这在某些系统中可能会降低转基因的表达效率。因此，质粒系统倾向配合使用高活性的启动子以确保Cas9的高水平表达，但是这也会增加脱靶效应和质粒DNA随机整合到宿主基因组中的风险。
重组病毒是递送CRISPR-Cas9的另一种常用工具，特别适合难以转染的细胞类型，并且可以创建稳定表达Cas9的细胞系以用于需要导入多个gRNA的实验。然而，该系统同样与质粒递送系统一样存在诸多相同的限制，包括依赖特定细胞类型的启动子，以及由于长期表达Cas9而导致的脱靶效应风险增加。此外，重组病毒也会带来较高的插入突变风险，特别是在逆转录病毒和慢病毒系统中的Cas9基因整合细胞基因组的时候。
通过gRNA-Cas9 RNP复合物递送可以绕过质粒和重组病毒系统的许多限制，同时实现快速编辑，因为不需要进行转录或翻译。然而，由于需要使用电穿孔方式实现高效的递送，这种方法同样主要限于体外应用。通过这种方法进行的基因编辑发生得很快，但随着Cas9在宿主细胞中被降解，编辑效果会迅速减弱，因此常受到可用的Cas9蛋白的类型限制。
与上述方法相比，使用gRNA和Cas9 IVT mRNA的混合物进行递送当前已被认为同样是一种高效的基因编辑方法，具有最小化脱靶效应的优点。该方法中，gRNA和Cas9 IVT mRNA一起被封装在脂质纳米颗粒或化学转染试剂中，使得该系统适用于体外和体内应用，并且无需担心存在整合宿主基因组的风险。此外，由于不需要进行转录，转基因的表达不依赖于特定的细胞类型启动子活性，翻译的发生也相对更快，从而实现快速且高效的基因编辑。与gRNA-Cas9 RNP复合物相比，mRNA形式的Cas9基因具有更长的表达时长，可达成充分的基因编辑效果。然而，mRNA最终也会被降解，编辑仅暂时发生过，从而限制了脱靶效应的影响。
总而言之，通过质粒、重组病毒和gRNA-Cas9 RNP复合物递送CRISPR-Cas9组分的方法均存在较多限制，对它们在许多场景中的应用造成了阻碍。这些方法具有明显的缺点，包括相对有限的编辑效率、较高的脱靶效应风险以及插入突变的潜在风险等。相对地，基于gRNA和Cas9 IVT mRNA混合物的递送方式具有诸多优点和较少的限制，是一种高效的基因编辑方法，应更多地被考虑用于基因编辑实验。
对于CRISPR介导的基因编辑，Cas9核酸酶通过特异性的gRNA作用至靶位点以产生DNA切割。在大多数情况下，为了实现简单的基因敲除，可以将单个gRNA与Cas9共同使用以产生DSB，然后通过NHEJ进行低效率的DNA修复，从而导致序列发生永久性突变，比如产生基因的小片段插入或碱基缺失。这类突变的一部分会导致基因的阅读框移码、出现提前终止密码子等，最终导致目的基因的功能丧失。
双gRNA则一般用于结合Cas9(D10A)切口酶对靶位点的两条反向DNA链进行切割。在这种方法中，切口酶将在两条链上产生单链切割，每一条链上的切割位点通过两条gRNA中的一条引导，然后在靶位点产生DSB。一般来说，这种方法减少潜在的脱靶效应，因为该种DSB的产生要求两条gRNA同时靶向序列。
当使用Cas9(D10A)切口酶和外源供体 DNA 模板将特定的碱基（例如敲入）引入感兴趣的基因时，也可以使用双gRNA。在这种方法中，两条反向的DNA链将被两个gRNA靶向位于所需突变位点两侧的两个位点，然后通过HDR途径利用外源DNA供体模板来修复切除的序列。
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